並列タイトル等Development of a influenza virus vector for practical use
タイトル（掲載誌）平成8(1996)年度 科学研究費補助金 基盤研究(A) 研究成果報告書 = 1996 Fiscal Year Final Research Report
一般注記1)インフルエンザウイルスNA分節に、IRESを介在配列として約100-1800bpの種々の外来遺伝子を導入したウイルスの回収を試みた。短い遺伝子は安定に導入されたが、発現は極めて低かった。最も長い遺伝子として麻疹HA遺伝子を導入したウイルスを回収したが、HA遺伝子の約70%を欠失していた。既存の技術を用いたインフルエンザベクター系には発現レベルと安定性に問題のあることが判明した。2)そこで、インフルエンザゲノム中最もサイズが小さく遺伝子発現レベルの高いNSゲノムを当面の標的とし、新たな遺伝子組換え技術の開発を行った。ウイルス粒子から単離したRNPをNSのcDNA存在下RNaseHで処理し、NSのcDNAから試験管内で再構成したRNPと共に細胞に導入することにより様々な変異ウイルスを回収した。NLS2(核移行シグナル2)及びエフェクタードメインを含むC端側半分を削除すると、ウイルスは弱毒化した。N端側半分に12残基の欠失を持つウイルスは温度感受性となった。ウイルス弱毒化のプロトコールが得られた。次に、CAT遺伝子をNSゲノムへ2Aプロテアーゼ配列を介在配列として導入し、ウイルスを回収した。3)サブジェノミックRNAの非コード領域に、ゲノム特異的認識シグナルの存在が確認された。今後サブジェノミック型ベクター開発にはこの領域への変異導入が必要である。4)インフルエンザウイルスRNA転写・複製を促進する宿主因子RAFを同定した。今後、大量発現のヘルパー細胞としてRAFの過剰発現が利用可能と思われる。
1) We have isolated and analyzed viruses containing foreign genes (100-1800bp) in the NA genome. Short inserts were stable but the expression was low. Insertion of the measles virus H gene lead to 70% deletion of the insert. Therefore, previously described protocol was shown to be insufficient for practical use.2) Then we have developed a novel protocol to isolate influenza transfectant containing mutations in the NS genome. The RNP,which was isolated from influenza virion, was treated with RNase H in the presence of NS cDNA.This was co-transfected to the cells together with in vitro-reconstituted NS RNPs. We successfully isolated several mutants in which deletion of the C-terminal half of the NS1 protein attenuated the virus. The deletion of 12 residues in the N-terminal half read to the temperature-sensitive phenotype. This would be good protocol to generate live attenuate vaccine.3) It was shown that noncoding region of the genome may contain segment-specific regulatory signals.4) A host factor was isolated which stimulates influenza virus RNA transcription and replication. This factor may be useful for efficient expression of proteins from the virus genome in the future.
研究課題/領域番号:07557215, 研究期間(年度):1995-1996
出典：「インフルエンザウイルスを用いた多目的ベクターの開発と実用化」研究成果報告書 課題番号07557215 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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