タイトル（掲載誌）平成13(2001)年度 科学研究費補助金 基盤研究(C) 研究成果報告書概要 = 2001 Fiscal Year Final Research Report Summary
一般注記金沢大学薬学部・分子細胞薬学
本研究では以下の2点に重点をおき研究をすすめた。(1)V_0V_1もしくはV_1、V_0の結晶化(2)V_0V_1 shaft subunitのATP水解に伴う回転の観察(1)あらゆる条件検討を行い、V_0V_1全体の結晶化を試みたが、十分な反射が出る結晶をえられなかった。そこでV_0、V_1に分離後、結晶化を試みた。V_1に関しては六角状の結晶を得る事ができたものの十分な反射が出ず、現在結晶化条件の検討を行っている。V_0に関してもL subunitを含む結晶化を得る事が出来たが、結晶が小さく解析に至っていない。このように構造解析への糸口を得る事ができたものの、研究期間内に構造を解くという目標は達成できなかった。(2)V_1のshaft subunitの同定及び発現系の構築には成功した。ピオチン化サイトの同定も終わり回転観察を実際に行ってみたが、1個だけ回転している分子を発見できたもののその再現性をとる事が出来ないでいる。データ解析に必要な30個以上の回転分子を観察するために、現在遺伝子改変などで発見確率を上げる実験を継続している。
V-type ATPase (V_0V_1) capable of ATP-driven H^+ pumping and of H^+ gradient driven ATP synthesis was isolated from a thermophilic eubacterium, Thermus ther-mophilus. When the enzyme was analyzed by gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sul-fate, it showed eight polypeptide bands of which four were subunits of V_1. We also isolated the V_0V_1 operon, containing nine genes in the order of atpG-I-L-E-X-F-A-B-D, which encoded proteins with molecular sizes of 13, 43, 10, 20, 35, 11, 64, 53, and 25 kDa, respectively. The last four genes were identified as those for V_0 subunits ; atpA, B, D, and F encoded the A, B, γ, and δ subunits, respectively. The first five genes, atpG-atpX, were identified as genes for the V_0 subunits. The product of atpL, the proteohpid subunit, lacked a 19-amino acid presequence and, unlike V-type ATPases, contained two membrane-spanning domains rather than four. The hydrophobic 43-kDa product of atpl is the smallest member so far found of the eukaryotic 100-kDa subunit family. Its electrophoretic band overlapped with the band of the A subunit. Therefore, all the gene products were found in our purified V_0V_1. We isolated the A_3B_3 subcomplex reconstituted from the isolated subunits and the A_3B_3γ subcomplex from subunit-expressing Escherichia coli. Electron microscopic observation of these subcomplexes revealed that the γ subunit of V_1 filled the central cavity of A_3B_3 and might be central subunit, similar to the γ subunit of F_1ATPase.
研究課題/領域番号:12680629, 研究期間(年度):2000 – 2001
出典：「V-ATPaseの作用機構の解明: 回転の解析と結晶化高次構造解析」研究成果報告書 課題番号12680629（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-12680629/126806292001kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
一次資料へのリンクURLhttps://kanazawa-u.repo.nii.ac.jp/?action=repository_action_common_download&item_id=57546&item_no=1&attribute_id=26&file_no=1
関連情報https://kaken.nii.ac.jp/ja/search/?kw=70271377
https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12680629/
https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-12680629/126806292001kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/
連携機関・データベース国立情報学研究所 : 学術機関リポジトリデータベース（IRDB）（機関リポジトリ）