ゲノム編集技術を用いたスプライシングサイトへのエピトープタグ導入技術開発

• Material Type: 文書・図像類
• Title: ゲノム編集技術を用いたスプライシングサイトへのエピトープタグ導入技術開発
• Author/Editor: 井端, 啓二
• Author Heading: 井端, 啓二
• Publication, Distribution, etc.: 慶應義塾大学
• Publication Date: 2017
• Publication Date (W3CDTF): 2017
• Alternative Title: ゲノム ヘンシュウ ギジュツ オ モチイタ スプライシング サイト エノ エピトープタグ ドウニュウ ギジュツ カイハツ; Genomu henshū gijutsu o mochiita supuraishingu saito eno epitōputagu dōnyū gijutsu kaihatsu; Identification of neurexin splicing isoform expressions in the brain using Cas9-triggered epitope-tag insertion
• Periodical title: 学事振興資金研究成果実績報告書
• Text Language Code: jpn; eng
• Target Audience: 一般
• Note (General): type:text; シナプス分子の一つであるNeurexinのアイソフォームのうちスプライスサイト4(30アミノ酸)を持つNeurexinには, シナプス形成因子であるCbln1が結合する。そのため, スプライスサイト4(30アミノ酸)を持つNeurexinの発現プロファイルを明らかにする事は, Cbln1の脳部位よる機能の違いを明らかにするために重要である。しかしながらスプライスサイト4を選択的に認識する抗体が存在しないため, 抗体を作る代わりに, CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて抗原(エピトープタグ)そのものをスプライスサイト4配列にノックインすることによって, スプライスサイト4を持つNeurexinを検出可能にする。本年度は3種類のNeurexin分子のそれぞれのスプライスサイト4にエピトープタグを連結し, Cbln1の結合, および, Neuroliginの結合への影響を調べた。また, スプライスサイト4(30アミノ酸)を持たないNeurexinを検出するために, スプライスサイト4が除去された時にのみエピトープタグが発現するコンストラクトも作製し, 抗体の結合を調べた。その結果, スプライスサイト4のN末端側にエピトープタグを連結した各Neurexinは, Cbln1, および, Neuroliginとの結合に影響を与えなかった。しかしながら, C末端側にエピトープタグを連結したNeurexinはCbln1との結合を消失する事が判明した。スプライスサイト4が除去された時にのみエピトープタグが発現するコンストラクトとして, スプライスサイト4除去後にエピトープが形成されるべくエピトープを2つに分割し, スプライスサイト4と隣接するエキソンにそれぞれ挿入した。しかしながら分割したエピトープも弱く抗体で認識され, さらなる条件検討が必要である事が判明した。 Neurexin is one of the most important presynaptic protein, which binds with postsynaptic molecules such as neuroligin at synapse. Neurexin has multiple splicing isoforms. Among them, splice site 4 is important for binding with Cbln1 which induces synapse formation in the central nervous system, especially in the cerebellum. In other brain region, it is speculated that Cbln1 also plays important role at synapses where splice site 4 containing neurexin is localized. To understand the characteristic of each synapse in the brain, it is important to know which neurexin isoform is expressed at each brain regions. To date, there are no splice site specific antibody for neurexin. So we tried to take advantage of epitope-tag and antibody detection system. Our future goal is inserting epitope-tag at splice site 4 of neurexin in the genome. In this research period, we selected location of tag insertion not to interfere with binding to Cbln1 and neuroligin. We also tried to make epitope-tag constructs which only expressed in splice site 4-negative neurexins. We found N terminal insertion of epitope-tag (A) at splice site 4 didn't interfere with binding to Cbln1 and neuroligin. However, C terminal insertion of epitope-tag at splice site 4 interfered with binding to Cbln1. To make epitope-tag only express in splice site 4-negative neurexins, we splited a certain epitope-tag (B) and put each fragment at 5 prime and 3 prime end of adjacent exons of splice site 4. However, antibody for this epitope-tag (B) slightly recognized splited epitope-tag (B), indicating we need further screening for splited epitope-tag.
• Access Restrictions: 限定公開
• Data Provider (Database): 国立情報学研究所 : 学術機関リポジトリデータベース（IRDB）（機関リポジトリ）; https://irdb.nii.ac.jp
• Original Data Provider (Database): 慶應義塾大学 : 慶應義塾大学学術情報リポジトリ