ゲノム編集タンパク質分泌合成システムとワンステップでの遺伝子改変動物作製法の構築

Material type: 文書・図像類

Author: 大西, 伸幸

Publisher: -

Publication date: 2021

Material Format: Digital

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Note (General)：: type:text本研究では、大腸菌タンパク質発現系を用いて、高精度型Cas9であるHypaCas9タンパク質をgRNAと同時に発現させ、リボヌクレオプロテインとして精製するシステムを構築した。大腸菌株の選定やタンパク質発現誘導条件・大腸菌破砕法を最適化することで、シングルバンドでHypaCas9タ...

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科研費研究者番号 : 40534540

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Material Type: 文書・図像類
Title: ゲノム編集タンパク質分泌合成システムとワンステップでの遺伝子改変動物作製法の構築
Author/Editor: 大西, 伸幸
Author Heading: 大西, 伸幸
Publication Date: 2021
Publication Date (W3CDTF): 2021
Alternative Title: ゲノムヘンシュウタンパクシツブンピツゴウセイシステムトワンステップデノイデンシカイヘンドウブツサクセイホウノコウチク
Genomu henshū tanpakushitsu bunpitsu gōsei shisutemu to wan suteppu deno idenshi kaihen dōbutsu sakuseihō no kōchiku
Development of easy-to-use genome editing protein synthesis system and one-step genetically modified animal production method
Periodical title: 科学研究費補助金研究成果報告書
Text Language Code: jpn
eng
Subject Heading: ゲノム編集
Target Audience: 一般
Note (General): type:text
本研究では、大腸菌タンパク質発現系を用いて、高精度型Cas9であるHypaCas9タンパク質をgRNAと同時に発現させ、リボヌクレオプロテインとして精製するシステムを構築した。大腸菌株の選定やタンパク質発現誘導条件・大腸菌破砕法を最適化することで、シングルバンドでHypaCas9タンパク質を精製することができた。具体的には、Cas9タンパク質合成で一般的に用いられているRosetta2(DE3)ではなくBL21(DE3)を採用し、低温ではなく30℃での発現誘導を行い、超音波ではなく凍結融解法ならびにリゾチームを用いてマイルドな条件で大腸菌破砕することで夾雑タンパク質を減少させることができた。 In this study, we developed a method to express HypaCas9 protein, which is a high-precision Cas9, and gRNA at a time using an E. coli protein expression system and purify them as ribonucleoprotein (RNP). By optimizing the selection of E. coli strains, protein expression induction conditions, and E. coli disruption method, HypaCas9 protein could be purified in a single band. Specifically, BL21 (DE3) is used instead of Rosetta2 (DE3), which is commonly used in Cas9 protein synthesis, and expression is induced at 30 °C instead of low temperature. Contaminant proteins could be reduced by disrupting E. coli under mild conditions using freeze-thaw and lysozyme instead of sonication.
研究種目 : 基盤研究 (C) (一般) 研究期間 : 2019～2021 課題番号 : 19K07696 研究分野 : 腫瘍生物学
Access Restrictions: 限定公開
Related Material: 科研費研究者番号 : 40534540
Data Provider (Database): 国立情報学研究所 : 学術機関リポジトリデータベース（IRDB）（機関リポジトリ）
https://irdb.nii.ac.jp
Original Data Provider (Database): 慶應義塾大学 : 慶應義塾大学学術情報リポジトリ