新規H^+/Cl^-シンポーターによるオートファジー・アポトーシス制御機構

Material type: 文書・図像類

Author: 大熊, 勝治ほか

Publisher: 金沢大学薬学部

Publication date: 2002-03

Material Format: Digital

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Note (General)：: 本研究は、新規H^+/CΓシンポーターであるプロジギオシン類のアポトーシス誘導機構解明に当たり、これまで殆ど注目されてこなかったオートファジーの役割を、体細胞遺伝学的・分子生物学的に明らかにしようとした。先ず、(1)プロジギオシン類のアポトーシス誘導機構を、オートファジーに注目して解明、動物細胞オー...

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Material Type: 文書・図像類
Title: 新規H^+/Cl^-シンポーターによるオートファジー・アポトーシス制御機構
Author/Editor: 大熊, 勝治
Ohkuma, Shoji
Author Heading: 大熊, 勝治
Ohkuma, Shoji
Publication, Distribution, etc.: 金沢大学薬学部
Publication Date: 2002-03
Publication Date (W3CDTF): 2002-03
Alternative Title: Control mechanisms of autophagy and apoptosis by a new group H^+/Cl^- symporting antibiotics
Periodical title: 平成13(2001)年度科学研究費補助金基盤研究(B) 研究成果報告書 = 2001 Fiscal Year Final Research Report
No. or year of volume/issue: 1999-2001
Volume: 1999-2001
Pages: 9p.-
Text Language Code: jpn
Subject Heading: H^+
CΓシンポーター
オートファジー
分化
アポトーシス
プロジギオシン
ドミナントネガティブ
二次元電気泳動
癌
bafilomycins
V-ATPase
PC12
apoptosis
neurite outgrowth (NOG)
prodigiosins
cell-differentiation
concanamycins
Target Audience: 一般
Note (General): 本研究は、新規H^+/CΓシンポーターであるプロジギオシン類のアポトーシス誘導機構解明に当たり、これまで殆ど注目されてこなかったオートファジーの役割を、体細胞遺伝学的・分子生物学的に明らかにしようとした。先ず、(1)プロジギオシン類のアポトーシス誘導機構を、オートファジーに注目して解明、動物細胞オートファジー関連遺伝子の同定を目指し、(2)CHO細胞を用いてオートファジー突然変異体を単離、(3)酵母オートファジー関連遺伝子の動物細胞ホモローグを単離、(4)オートファジーに伴って発現量の変動する遺伝子・蛋白資を同定。動物細胞オートファジー関連遺伝子が単離された暁には、(5)アポトーシスに伴うオートファジー関連遺伝子の動態を解明、(6)アポトーシスにおけるオートファジー関連遺伝子機能を、トランスフェクタント(ドミナント・ネガティブ体の強制発現等を含む)作成を通じて解明。平行して、(7)各種癌細胞に対する、H^+/Γシンポーターのアボトーシス誘導型制癌剤の可能性を追及、した。先ず、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いて、Wortmannin,3-methyladenine他の各種選択的阻害剤を用いて解明する系を確立した。次に"プロジギオシン類H^+/CΓシンポーターの、オートファジー・アポトーシス制御における働きを、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いて、蛍光を指標として生化学的・細胞生物学的に解析した。同時に、細胞内pH測定を通じて、H^+/Cγシンポーターのどのような活性が関与するかを解析した。その結果、PC12細胞の分化誘導とアポトーシス誘導にはオートファジー自体は関与していないことが示唆された(日本薬学会発表)。また、体細胞分子遺伝学的にオートファジー変異体の単離を目指して、CHO細胞を用いて実験系を確立した。今後、(毒素等を利用した)細胞生存率と、強制発現させたGFP蛋白質の分解異常を指標とし、フローサイトメトリー・セルソーター法を主に使い、動物細胞のオートファジー変異体を選択したい。リソソーム膜融合反応に必要なシンタキシン・ホモローグの単離・同定には成功しているが、それがオートファゴソームとリソソームの膜融合に必須であるか否かは決定出来ていない。酵母遺伝子のヒトホモログ釣りは成功し、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いてドミナントネガテイブ体を作成し、その遺伝子産物の動物細胞オートファジーにおける役割を解明した(投稿準備中)。また、一次元・二次元電気泳動法等を用いて、オートファジーに伴い量的に変動する蛋白質を単離・同定。現在、各種処理で誘導されるタンパク質に差を見い出している(投稿準備中)。更に、種々の合成化合物について、H^+/CΓシンポーターとして満たすべき構造を検討している。ヌードマウスに移植した膵癌由来細胞に対して、プロジギオシン類似体H^+/CΓシンポーターも制癌効果を示すことを見い出している(投稿準備中)。
In this project, we have investigated the role of autophagy in the induction of neurite outgrowth (NOG), growth inhibition and apoptosis by a new type of H^+/CL^- symporting antibiotics like prodigiosins.We found the followings: (1) Prodigiosins, like bafilomycins, inhibited pancreatic cancer transplanted into nude mice. (2) Prodigiosins also induced apoptosis and NOG in RNA_-, protein-syntheses, and serine/threonine kinase-dependent manners, and K_-252_<a-> or A_-kinase-independent manners, but induced apoptosis differently from NOG in its in-sensitivity to tyrosine phosphates inhibitors. (3) E-58591, a prodigiosin-like tambjamine antibiotics, also showed H^+/CL^- symport activity and strongly inhibited spleen cell immune responses, gastric acid secretion and inhibited osteoclastosis and induced NOG at higher concentrations. (4) We have succeeded in the synthesis of affinity probe for concanamycins (analogs of bafilomycins) and showed concanamycin-induced NOG from outside of plasma membranes. (5) 3-Methyladenine, and inhibitor against autophagy, did not induce apoptosis in the presence of serum, suggesting little participation of autophapy on the bafilomycin-induced apoptosis. (6) We isolated human-homologs of autophagy-related genes from HeLa cells. They showed cell death of CHO in the absence of amino acid- or serum-free medium. (7) We established a system to look into degradation of GFP-labeled organelles (mitochondria and peroxisomes). (8) We showed that apoptosis and NOG was not induced by pH-differences between inside and outside of cells, because they were not induced by NH_4Cl. (9) Prodigiosins also strongly and reversibly uncoupled (H^+/K^+) ATPase-dependent proton-translocation from rabbit gastric mucosa. (10) We have succeeded in the cloning, proton pump-dependent ATP synthesis, and determation of operon structure of V-ATPase from a eubact rium (Thermus termophilus).
研究課題/領域番号:11470483, 研究期間(年度):1999-2001
出典：「新規H^+/Cl^-シンポーターによるオートファジー・アポトーシス制御機構」研究成果報告書　課題番号11470483(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作成
DOI: 10.24517/00050624
Access Restrictions: 限定公開
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https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11470483/
https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-11470483/114704832001kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/
Data Provider (Database): 国立情報学研究所 : 学術機関リポジトリデータベース（IRDB）（機関リポジトリ）
https://irdb.nii.ac.jp
Original Data Provider (Database): 金沢大学 : 金沢大学学術情報リポジトリKURA