レンサ球菌のサイクリックADPリボース代謝酵素の一次構造の決定と活性部位の解析

• Material Type: 文書・図像類
• Title: レンサ球菌のサイクリックADPリボース代謝酵素の一次構造の決定と活性部位の解析
• Author/Editor: 唐澤, 忠宏; Karasawa, Tadahiro
• Author Heading: 唐澤, 忠宏; Karasawa, Tadahiro
• Publication Date: 1999-03-15
• Publication Date (W3CDTF): 1999-03-15
• Alternative Title: The gene encoding streptococcal NAD^+-glycohydrolase: datermination of primary structure and analysis of enzymatic active sites
• Periodical title: 平成9(1997)年度 科学研究費補助金 基盤研究(C) 研究成果報告書概要 = 1997 Fiscal Year Final Research Report Summary
• No. or year of volume/issue: 1996-1997
• Volume: 1996-1997
• Pages: 2p.-
• Text Language Code: jpn
• Subject Heading: A群レンサ球菌; Streptococcus pyogenes; NAD; cyclic ADP-ribose; cloning
• Target Audience: 一般
• Note (General): 金沢大学大学院医学系研究科; 1.レンサ球菌サイクリックADPリボース(cADPR)代謝酵素N末アミノ酸配列に相当する遺伝子断片のクローニング精製酵素のN末アミノ酸配列を決定し、PCR用オリゴヌクレオチドプライマーを作製した。種々の条件を検討しながらA群レンサ球菌DNAを鋳型にPCRを行った結果、予想される大きさのDNA断片(120bp)が増幅された。このDNA断片をクローニングし、塩基配列を決定したところ、レンサ球菌cADPR代謝酵素をコードする遺伝子の一部であることが判明した。2.cADPR代謝酵素遺伝子塩基配列(1次構造)の決定と発現系の構築上記120bpDNA断片をプローブにして行ったサザンブロット解析をもとに、染色体遺伝子プラスミドライブラリーを構築した。次に、プラスミドベクター上に設計したプライマーと120bpDNA断片上のプライマーによりsingle specific primer-PCRを行い、その増幅産物の塩基配列を決定した。目的遺伝子は全長1,353bpで451アミノ酸残基の分子量50,703の蛋白質をコードしていた。精製酵素のN末端との比較から,37アミノ酸残基のシグナル領域を持つことが推定された。また、このレンサ球菌cADPR合成・分解酵素は1次構造上、cADPR代謝活性を示す酵素である哺乳動物リンパ球表面抗原CD38、骨髄幹細胞抗原BST-1やアメフラシADP-ribosyl cyclaseとの相同性は認められなかった。決定した塩基配列をもとに、PCRを用いて本酵素構造遺伝子全長をクローニングし、大腸菌内で発現させた。その結果、ウェスタンブロット解析にて元株と同じ位置にバンドが検出され、酵素アッセイにてNAD分解活性・cADPR代謝活性が確認された。以上のことからレンサ球菌cADPR合成・分解酵素は新しいタイプのcADPR代謝酵素であると考えられた。; 1. Cloning of a DNA fragment corresponding to the N-terminus amino acid sequence of streptoccal NAD^+-glycohydrolaseAn N-terminus amino acid sequence of streptococcal NAD^+-glycohydrolase was determined by using the purified enzyme. To amplify a DNA fragment which corresponded to the N-terminus amino acid sequence, PCR-primers were designed and PCR was done. A DNA fragment which had the expected size (120 bp) was amplified. The nucleotide and the deduced amino acid sequences of this fragment revealed that this fragment was a part of the gend encoding NAD^+-glycohydrolase.2. Primary structure of the gene encoding NAD^+-glycohydrolase and construction of its expression systemSouthern blot analysis was done using the 120-bp DNA fragment. It was shown that the gene encoding NAD^+-glycohydrolase was contained as a single copy in chromosome. Plasmid libraries of chromosomal DNA from Streptococcus pyogenes C2556 were constructed. Single specific-PCR was preformed using primers designed from sequences of the plasmid and of the 120-bp DNA fragment. The nucleotide sequence of the amplicon was determined. The open reading frame was ca.1400 bp. Calculated molecular weight and pI were ca.50,000 and 8.5, respectively. These properties were consistent with those of the purified enzyme. Full length of the gene encoding NAD^+-glycohydrolase was cloned and expressed in Escherichia coli. Cell extracts showed not only NAD^+-glycohydrolase activity bu also cyclic ADP-ribose-synthesis and -hydrolysis activities. Enzymatic active portions are currently under investigation.; 研究課題/領域番号:08670303, 研究期間(年度):1996-1997; 出典：研究課題「レンサ球菌のサイクリックADPリボース代謝酵素の一次構造の決定と活性部位の解析」課題番号08670303（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-08670303/086703031997kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作成
• DOI: 10.24517/00056889
• Source: https://kanazawa-u.repo.nii.ac.jp/?action=repository_action_common_download&item_id=50580&item_no=1&attribute_id=26&file_no=1
• Access Restrictions: 限定公開
• Rights (production): CC BY-NC-ND
• Related Material: https://kaken.nii.ac.jp/search/?qm=90251917; https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08670303/; https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-08670303/086703031997kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/
• Data Provider (Database): 国立情報学研究所 : 学術機関リポジトリデータベース（IRDB）（機関リポジトリ）; https://irdb.nii.ac.jp
• Original Data Provider (Database): 金沢大学 : 金沢大学学術情報リポジトリKURA