塩漬食肉製品の色調安定性に係る諸因子の研究

• Material Type: 博士論文
• Title: 塩漬食肉製品の色調安定性に係る諸因子の研究
• Author/Editor: 和賀, 正洋
• Author Heading: 和賀, 正洋
• Publication Date: 2017-03-15
• Publication Date (W3CDTF): 2017-03-15
• Degree grantor/type: 麻布大学
• Date Granted: 2017-03-15
• Date Granted (W3CDTF): 2017-03-15
• Dissertation Number: 甲第67号
• Degree Type: 博士(学術)
• Conferring No. (Dissertation): 甲第67号
• Text Language Code: jpn
• Target Audience: 一般
• Note (General): 背景と目的 食品の外観は消費者にとって購買を決定付ける要素であり、退色等が起こった場合、製品価値は著しく低下する。塩漬食肉製品の色調は食肉色素であるミオグロビン（Mb）に対し一酸化窒素（NO）が配位したニトロシルミオグロビン（NOMb）が主要な色素であって、この色素を安定化させることで退色を防止することができる。この退色防止に対し、酸素の遮断が最も効果的かつ現実的な方法として知られており、一般的な塩漬食肉製品の色調安定性は包装材料の酸素バリア性に依存している。一方で、残存亜硝酸根が退色に対して抑制的に働くことや、酸素以外にもMbの配位安定性に影響する因子が複数知られていることから、これらについて明らかにすることでNOMbの安定化に対し包装材料以外の対策を見出す可能性がある。そこで本研究では亜硝酸根の挙動ならびにMbの配位結合安定性に係る諸因子について検討した。材料と方法１．亜硝酸態窒素（NO2）の還元分解反応 10 mMのアスコルビン酸Naと25 mMのNO2を含む各種pHの緩衝液をNO2還元分解モデル反応液とした。NO2、硝酸態窒素（NO3）および還元型アスコルビン酸Naの自己吸光から還元分解反応中のこれらの濃度をリアルタイムで評価した。また、反応中の酸素濃度は溶存酸素計で測定し、反応前後でpHを評価した。２．Mbの配位結合安定性に及ぼす外的要因pHの影響：試験に用いる牛肉は、Mbのメト化率を測定したものを用いた。CO処理した牛肉から4℃、各種pH緩衝液でMbを抽出しカルボキシミオグロビン（COMb）濃度を測定した。なお本抽出では酸素を制御せず、好気的な条件下で抽出を行った。また、抽出後の溶液は静置後にCOMb濃度を算出し、初期濃度との比較からCOMb安定性を評価した。温度の影響：一酸化炭素（CO）処理牛肉から0.1 Mトリス緩衝液（pH 8.5）を用いて1、10、20および30℃で好気条件下においてMbを抽出し、COMb抽出率を評価した。酸素の影響：CO処理牛肉から1℃、pH 8.5、好気条件下でMbを抽出した場合（好気抽出）と、同様に1℃、pH 8.5で抽出環境を窒素パージした場合（嫌気抽出）とでCOMb抽出率を評価した。光の影響：CO処理牛肉から嫌気抽出した溶液を氷温下で明所（1,000 lx）と暗所でそれぞれ保管し、COMb濃度の安定性を評価した。波長特異性：塩漬食肉製品から抽出したNOMbに対し分光した光を照射し、照射前後のNOMbの吸光度からその残存率を算出し、照射光の波長がNO解離へ与える影響を評価した。３．加熱がMbの配位結合安定性に及ぼす影響単離Mbと食肉中Mbとの加熱安定性の評価：単離Mbは、豚肉水溶性画分を硫安分画80-100%で粗精製した後、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）によって精製した。この単離Mbの加熱安定性は、比較する豚肉と同等濃度の水溶液とした後、昇温速度2 ℃/minで加熱したときの凝集性で評価した。豚肉中のMbの加熱安定性は、各温度で加熱した豚肉中の水溶性Mb濃度から評価した。加熱に伴う構造変化の評価：単離Mbについて、トリプトファンを指標とした質量中心法で表面構造の変化が起こる温度を、示差走査熱量計で吸熱を伴う構造変化が起こる温度をそれぞれ評価した。加熱Mbの配位結合安定性：単離Mbは70℃で加熱あるいは加熱せずにハイドロサルファイトNa（Na2S2O4）で還元後COを通気し、HICカラムでNa2S2O4を洗い流し、酸化還元電位からNa2S2O4が残っていないことを確認したうえでCOMbとした。このようにして得られたCOMbの安定性を評価した。結果と考察１．亜硝酸態窒素の還元分解反応 還元分解のモデル反応液においてNO2の減少速度はpHに反比例した。また、亜硝酸対窒素の還元分解反応に伴い還元型アスコルビン酸は減少した。還元型アスコルビン酸が枯渇すると、NO2の減少は観察できなくなった。この反応において、NO2の減少速度は還元型アスコルビン酸が枯渇する直前まで一定であった。還元分解反応速度は非解離性の亜硝酸（HNO2）の濃度を反応基質とした2次反応の挙動を示したことから、NO2の還元分解反応速度に対するpHの影響は、反応速度のHNO2濃度依存性を反映したものだと考えられた。 pH 5.5程度でNO2の減少速度が小さい場合、反応初期にNO2の減少が見られなかったが、酸素濃度は反応開始直後から急激に減少した。このことから、反応速度が小さいときに見かけ上NO2が減少しないように観察されるのは、反応によって生じたNOが液中の酸素と反応してNO2を生じることによると考えられた。このことは、NO2の分解反応が系内を嫌気的に保つ働きを有することを示唆しており、食肉製品の保存性を高めていると考えられる。さらに、系内に酸素がある場合にはNO2分解反応が起こり続けることが示唆された。また、NO2の分解が進行するとともに、液中のpHは増加した。このことは、NO2の分解自体がNO2の分解速度を低下させるようフィードバックすることを示している。すなわち、系内に一定速度で酸素が流入する場合にはNO2分解反応が繰り返されてpHが上がるためにNO2の分解速度が低下し、やがてNOが蓄積しなくなることを示している。塩漬食肉製品を発色させるためには、工程中に食肉を嫌気的に保つことが必須であり、酸素に曝露された面では発色は起こらない。本知見はこのような現象としての発色を裏付けるものであり、塩漬食肉製品の保存中のNO蓄積ならびに色調保持においても同様の機序が働いていると考えられた。以上のことから、食肉製品中の発色剤は酸素によってNOとNO2の形で循環し、この循環によって発色効果を失っていくことが示唆された。２．Mbの配位結合安定性に及ぼす外的要因 COMbの抽出率にpH依存性はなかったものの、pHが高いほどCOMbの安定性は高まった。一般的に、Mbヘムポケット中のNOの解離はNO分子と酸素との反応が関係しているが、COは酸素などの競合分子と反応しない。このことから、COはその解離度がMbの配位結合安定性を示す指標となると考えられた。したがって、COMbの安定性がpHによる影響を受けたことは、pHがMbの配位結合安定性に影響する可能性を示したといえる。次に、COMb抽出率は温度と反比例し、温度の上昇に伴う分子運動の活発化がCOの解離を誘起することが示唆された。また、COMbは酸素存在下では抽出率が低下したことから、COと酸素の分圧差が大きくなると酸素と比較して3万倍のMb親和性を持つCOであっても酸素に置換されると考えられた。最後に、抽出されたCOMbは光の曝露によって安定性が低下したことから、COMbが吸収した光エネルギーによって励起、格子緩和が起こってMbの配位結合安定性が損なわれることが示唆された。 COをモデル分子とした以上の検討から、Mbの配位安定性を低下させる要因として、pH、温度、競合リガンドおよび光が影響することが示唆された。『NOMbを用いた検討によって、近年報告されているとおりNOMbの光に対する安定性には波長特異性があり、可視光域の光源によっても退色が促進されることが示唆された。光によるNO解離の機序はCOと同様と考えられる一方、NOMbはCO誘導体や酸素誘導体と比較して光感受性が極めて高く、NOの解離に際してONOOの形成など別の要因が関与していると考えられた。』３．加熱がMbの配位結合安定性に及ぼす影響について 加熱凝集性を確認した結果、単離Mbは76℃まで沈殿が起こらなかったのに対し、食肉中のMbは43℃以上で徐々に水溶性を失った。すなわち、Mbは食肉中で熱安定性が低かった。単離したMbでは吸熱を伴う構造変化は73℃付近で、表面のトリプトファンを指標とした場合の変性は43℃程度から70℃にかけて起こったことから、表面の変性が食肉中のMbの変性と、吸熱を伴う構造変化がMbの変性と、それぞれ相互関係があると推定された。食肉中のMbが単離したMbよりも低い温度で沈殿した原因は、Mb以外の低温で加熱凝集する水溶性タンパク質との共沈殿によると考えられる。70℃で加熱したMbのCOの配位結合安定性は非加熱のMbのものと変わらなかったことから、加熱はCOの配位安定性に影響しないと考えられた。また、変性過程の食肉からMbを抽出した結果、酸化状態である3価鉄のMbから順次水溶性を失うことが示唆された。 以上の結果から、本研究では塩漬食肉製品の色調安定性に係る諸因子として、NO2の分解ならびにNOの蓄積挙動、Mbに結合する配位子の安定性に対する競合分子ならびに光の影響、表面の変性が起こる温度でもMbの配位結合力は損なわれないことを明らかにした。 今後これらの基礎知見は、塩漬食肉製品の色調安定性の向上を検討する上で有用な足がかりになるものと期待される。; The color stability has a major impact on the market value of the cooked cured meat products. While the mechanisms of color development and the color preservation of meat have been understood basically, it have not been clear about the factor affecting coordination bond stability of myoglobin (Mb) or the accumulation behavior of nitric monoxide (NO) in meat.The purpose of this study is to uncover the reactions related to NO-accumulation and the factor affecting coordination bond stability of Mb.The behavior of NO was thought to be important for the color stability of cured meat products because it is the ligand forming nitrosyl-myoglobin (NOMb) which is a responsible pigment for the cured meat color. Therefore, the reactions related to NO accumulation was investigated in chapter 1. To estimate the reactions, it was essential to establish the method for observation of nitrite nitrogen (NO2) and nitrate nitrogen (NO3). At first, the observation method using the self-absorptions for NO2, NO3 and reduced ascorbic acid (AsA) was improved. In contrast to the Griess reaction method or the fluorescent method using 2,3- diaminonaphthalene, determination inhibition by AsA did not occur in the method using the self-absorptions. The concentration of NO2, NO3 and AsA was determined using an absorption at 324, 302 and 266 nm, respectively. In this method, the concentration of NO2, NO3 and AsA could be observed in real time in vitro model system because the observation conducted without addition of any reagents. NO accumulation in the head space of commercial cooked cured meat products was showed, and the O2 dependence of NO accumulation was demonstrated. In the model solution of NO2 reductive degradation reaction, there was some time lag until NO2 breakdown occurs while O2 decrement was observed immediately. The time until increasing the pressure in headspace of the model solution was longer than the time that elapses before NO2 decrement occurs in the model solution. Therefore, NO could be accumulate in the absence of O2 in the liquid/gas phase. These results suggested that the NO serves as a scavenger of O2 which trapped during processing or penetrate into packages during storage. It was expected that NO concentration should promote NOMb stability to competitive molecules as with the other Mb derivatives. Based on the reactions of NO and O2, the actual competitive molecules could not be O2, but OH- or H2O, and these molecules have a far lower affinity to Mb than that of NO. As ever, O2 thought to be undesirable molecules since O2 consumptions NO or react with NO in Mb to form Mb-ONOO. NO is formed via 2 different pathways depending on the presence of reductants. The reaction balance and the rate-limiting factor of NO2 auto-decomposition reaction and NO2 reductive decomposition reaction were investigated respectively. The reaction balance of NO2 reductive decomposition pathway was agreed with known findings. However, the reaction pathway was second-order reaction, and the reactive substrate was nitrous acid (HNO2). Contrary to an earlier theory, the results suggested that NO2 decomposition reaction rate was independent from the concentration of AsA. The observation was achieved by the method free from AsA-inhibition, and real time observability. The reaction of NO2 auto-decomposition was affected by HNO3 composition rate to total acid, and this, the reaction should be reversible. This result suggested that the added nitrate could be inhibit the NO2 decrement in cooked cured meat. However, the effect of nitrate was not observed in presence of AsA. It thought to be due to the reaction rate which is higher in reductive pathway than that of auto-decomposition pathway. Since a meat has reducing group such as –SH group, it should be expect only a limited effect of nitrate as a NO2 decomposition inhibitor in cooked cured meat products.These results of chapter 1 suggests that NOx are circulating in a cooked cured meat package due to the O2. Additionally, the NO2 reductive decomposition reaction would keep the rate until the reductant deplete unless a pH changing. However, the pH in unbuffered solution was increased as the NO2 decomposition reaction proceeded. Thus the reaction rate would decrease with time in meat products despite the presence of reductant. In the next phase, following reductant depletion, NO2 decomposition pathway would change to auto-decomposition pathway. The stability of the ligand coordinated with Mb could not be affected only by the concentration of ligand but also by the external factor or the Mb itself. Therefore, the effects of external factor on the stability of coordinated ligands and the thermal denaturation of Mb with the object of stability of coordination bond ability were investigated in chapter 2. To evaluate the effects of external factor on the stability of Mb derivatives, CO was used as model ligand because of the property which have no involvement in oxidation reactions, and which could be evaluate the binding rate. O2, pH, temperature and light were investigated as the external factor. The presence of O2 and pH decrement induced carbonmonoxy-myoglobin (COMb) decomposition which would be by the increment in concentration of competitive molecules. CO dissociation rate was increased with temperature rising and exposure of light which would be due to the molecule excitation. While light sensibility have been well known as the characteristics of NOMb, the character was also observed in COMb or OxyMb. These results suggests the presence of the wavelength of light which decompose Mb derivatives specifically. Therefore, the stability of NOMb with the each wavelength of light was investigated. It was revealed that NOMb become unstable with the light which absorbed by NOMb. It was thought that the Mb coordination bond ability could be affected by thermal denaturation. Therefore, the thermal stability of Mb in terms of the coordination ability was investigated. The decrement of stability in ligand coordination stability of Mb have been estimated by the denaturation of the coordination position. Thus, in this study, the thermal properties of purified Mb and Mb in meat were compared. At first, the rapid purification method for Mb and the method for simultaneously determining Mb, hemoglobin (Hb) and Cytochrome c (Cyt c) in meat were improved. Next, the thermal effects on the purified Mb and the Mb in meat was evaluated with the improved methods. The thermal kinetics of Mb was different between the purified Mb and the Mb in meat. The purified Mb was more stable than the Mb in meat. The reason of this trait would be due to the thermal denaturation of surface of Mb since the temperature that Mb lost the water solubility and the temperature that the thermal change was occur in surface of Mb which evaluated with tryptophan as an indicator was same. The coordination bond stability of Mb with CO as a model did not decrease with following the heat treatment. This result suggested that thermal decrement in the stability of Mb derivatives was occurred not by thermal denaturation of Mb itself but by co-denaturation of Mb and the other proteins such as coprecipitation.The presence of competitive molecules, temperature and light exposure were demonstrated as the external factor which effect on the stability in ligand coordination stability of Mb in chapter 2. Especially, the light sensibility of Mb derivatives were related with the absorptions. Contrary to an earlier theory, the results suggested that the decrement in the stability of Mb derivatives was occurred not by thermal denaturation of Mb itself. The proteins which coprecipitation with Mb and/or the thermal deactivation of Mb reductase was/were thought to be related.In conclusion, the kinetics of NO2 decomposition and NO accumulation, the effects of pH, temperature and presence of competitive molecules on the stability of Mb derivatives, and thermal stability of coordination ability in Mb were investigated as the factors affecting color stability of cured meat products in this study. While these results could be provide a novel approach for stabilizing the color of meat or meat products, further research must be necessary to apply these perceptions to practical situations. Besides, following methods improved in this study would be valuable tool for some time to come to study the color stability of meat or meat products: The determination method for NO2, NO3 and AsA using their self-absorptions; the determination methods for COMb; high throughput method for Mb purification using HIC; method for simultaneously determining Mb, Hb and Cyt c in meat.
• Persistent ID (NDL): info:ndljp/pid/10342688; https://dl.ndl.go.jp/pid/10342688
• Collection: 障害者向け資料
• Collection (Materials For Handicapped People:1): テキストデータ
• Collection (particular): 国立国会図書館デジタルコレクション > デジタル化資料 > 博士論文; https://dl.ndl.go.jp/collections/A00014
• Acquisition Basis: 博士論文（自動収集）
• Date Accepted (W3CDTF): 2017-05-02T23:17:13+09:00
• Date Created (W3CDTF): 2017-04-07
• Format (IMT): PDF
• Access Restrictions: 国立国会図書館内限定公開
• Service for the Digitized Contents Transmission Service: 図書館・個人送信対象外
• Availability of remote photoduplication service: 可
• Periodical Title (URI): http://id.nii.ac.jp/1112/00004520/
• Data Provider (Database): 国立国会図書館 : 国立国会図書館デジタルコレクション; https://dl.ndl.go.jp