In vitro アッセイ系を用いたゴム老化防止剤4-メチル-または5-メチル-2-メルカプトベンズイミダゾールの代謝的相互作用に関する毒性学的研究

• Material Type: 博士論文
• Title: In vitro アッセイ系を用いたゴム老化防止剤4-メチル-または5-メチル-2-メルカプトベンズイミダゾールの代謝的相互作用に関する毒性学的研究
• Author/Editor: 黒田, 幸恵
• Author Heading: 黒田, 幸恵
• Publication Date: 2021-11-22
• Publication Date (W3CDTF): 2021-11-22
• Alternative Title: Toxicology study about metabolic interaction of rubber antioxidant 4-methyle or 5-methyle-2- mercaptobenzimidazole using in vitro assays
• Degree grantor/type: 麻布大学
• Date Granted: 2021-11-22
• Date Granted (W3CDTF): 2021-11-22
• Dissertation Number: 乙第441号
• Degree Type: 博士(獣医学)
• Conferring No. (Dissertation): 乙第441号
• Text Language Code: jpn
• Target Audience: 一般
• Note (General): 1. はじめに 化学物質による毒性は、その生体内における代謝により大きく影響される。すなわち、化学物質は代謝されることにより、毒性が弱まる解毒、または毒性が強まる活性化を受ける。一方、肝臓に量的に最も多く存在し、基質特異性が低いために、多種類の化学物質の代謝に関与する酵素であるチトクロームP450（CYP）は、化学物質によりその活性が誘導または阻害されることがある。誘導または阻害されたCYPが他の化学物質の代謝に関与する場合には、その化学物質の毒性が影響を受ける代謝的薬物間相互作用が起こる可能性がある。したがって、化学物質の毒性評価においては、CYPを誘導または阻害する作用および代謝的薬物間相互作用を考慮した毒性学的評価が必要である。しかしながら、代謝的薬物間相互作用については、現在のところ画一的な評価方法は存在しないため、個々の化学物質について研究的に調べる必要がある。 本研究におけるメチル化-2-メルカプトベンズイミダゾールとは、2-メルカプトベンズイミダゾール（2-mercaptobenzimidazole、MBI）の4位または5位のメチル化誘導体である4-メチル-2-メルカプトベンズイミダゾール（4-methyle-2-mercaptobenzimidazole、4-MeMBI）および5-メチル-2-メルカプトベンズイミダゾール（5-methyle-2-mercaptobenzimidazole、5-MeMBI）である。工業的に用いられる4-MeMBIおよび5-MeMBIの1対1混合物を4(5)-MeMBIと略称し、これらのメチル化MBIを総称する場合はMethyl-MBIsと略称する。 4(5)-MeMBIおよびMBIはゴム老化防止剤などとして工業的に幅広く利用されており、生分解性の低い環境汚染物質として知られている。そのため、ヒトの健康への影響が懸念されることから、様々な毒性学的研究が行われている。 Methyl-MBIsおよびMBIは、そのチオウレア構造による強い甲状腺毒性を有することが、ラットを用いて明らかにされている。ラットを用いた反復および単回投与試験では4(5)-MeMBIの毒性はMBIよりも弱く、甲状腺毒性を示すペルオキシダーゼ阻害活性もまた、4-および5-MeMBIはMBIよりも弱かった。4-MeMBIは最も弱かった。甲状腺重量を指標とした毒性評価では5-MeMBI単独よりも混合物4(5)-MeMBIで弱い毒性を示し、混合物内の被験物質における相互作用により毒性が減弱した可能性が示唆された。一方、肝肥大を指標とした肝毒性については4-MeMBIまたは5-MeMBIと4(5)-MeMBIとの間に差は認められず、肝臓における作用が関与するものと考えられた。反復投与による肝CYPの活性およびタンパク量への影響を調べた報告では、4-MeMBIはCYP1Aを、5-MeMBIはCYP2Bをそれぞれ強く誘導したが、4(5)-MeMBIでは4-MeMBIと5-MeMBIとによる相加作用は認められなかった。これらの報告から、4(5)-MeMBIの相対的に低い毒性は、4-MeMBIと5-MeMBIとのCYP誘導または阻害を介した代謝的薬物間相互作用によると考えられているものの、現在のところ画一的な評価方法は存在しないため、個々の化学物質について研究的に調べる必要がある。 本研究では、4-MeMBIおよび5-MeMBIによる代謝的薬物間相互作用を明らかにすることを目的とした。ウサギ角膜由来細胞株SIRC細胞を用いてMethyl-MBIsおよびMBIの細胞毒性を調べた。続いて、ラット肝ミクロゾーム、ラットおよびヒト初代培養肝細胞を用いたin vitro実験系により、4-MeMBIおよび5-MeMBIについて、CYPによる代謝、CYPの誘導を調べた。これらのin vitro実験系では、in vivo実験に比べて、解析および評価が容易な結果が得られることが期待される。2．ウサギ角膜由来細胞株SIRC細胞におけるMBI、4-MeMBI、5-MeMBIおよび4(5)-MeMBIの細胞毒性 SIRC細胞におけるMBI、4-MeMBI、5-MeMBIおよび4(5)-MeMBIの細胞毒性をクリスタル・バイオレット染色性試験により検討した。細胞生存率から半数致死濃度（LC50）を算出した結果、細胞毒性の強度は5-MeMBI ≧ 4-MeMBI ≧ 4(5)-MeMBI ＞ MBIであることを明らかにした。Methyl-MBIsは類似した細胞毒性を示し、MBIよりも強い細胞毒性を示したことから、ベンゼン環にメチル基が存在するとMBI誘導体の細胞毒性が高まることを示唆している。さらに、SIRC細胞は薬物代謝酵素活性が低いことから、in vivoにおけるMethyl-MBIsの低い甲状腺毒性および肝毒性は薬物代謝酵素の誘導によるものであるという仮説を支持した。（Kuroda Y*, Miyajima A*, Sakemi-Hoshikawa K, Usami M, Mitsunaga K, Ohno Y, Sunouchi M. In vitro cytotoxicity of the thyrotoxic and hepatotoxic rubber antioxidant 2-mercaptobenzimidazole and its 4- or 5-methyl derivatives in rabbit corneal cells. Fundamental Toxicological Sciences. 2020, * These authors equally contributed to this work.）3．ラット肝における4-MeMBI、5-MeMBIおよびMBIの代謝 ラット肝ミクロゾームにおける4-MeMBI、5-MeMBIおよびMBIについて、CYPによる代謝量をHPLC法により調べた。その結果、4-MeMBI、5-MeMBIおよびMBIは、時間依存的にCYPにより代謝されることが明らかになった。CYP1A誘導剤β-ナフトフラボン、CYP2B 誘導剤フェノバルビタールおよびCYP2E誘導剤イソニアジド処理した肝ミクロゾームを用いた実験から、4-MeMBIおよび5-MeMBIの代謝には、CYPs 1Aおよび2Bが関与し、いずれもCYP2Bにより依存的であることが明らかになった。以上の結果および報告されているin vivo実験の結果から、4(5)-MeMBIの代謝においては、4-MeMBIにより誘導されたCYP1Aおよび5-MeMBIにより誘導されたCYP2Bにより、5-MeMBIおよび4-MeMBIのそれぞれが効率的に代謝される、代謝的薬物間相互作用が示唆された。（Miyajima A*, Kuroda Y*, Sakemi-Hoshikawa K, Usami M, Mitsunaga K, Irie T, Ohno Y, Sunouchi M. In vitro metabolism of 4-methyl- and 5-methyl-2-mercaptobenzimidazole, thyrotoxic and hepatotoxic rubber antioxidants, in rat liver microsomes. Fundamental Toxicological Sciences. 2018, * These authors equally contributed to this work.）4．ラットおよびヒト初代培養肝細胞における4-MeMBI、5-MeMBIおよびMBIのCYP活性に及ぼす影響 CYPの誘導による4(5)-MeMBIにおける代謝的薬物間相互作用をさらに調べるために、ラット初代培養肝細胞およびヒト初代培養肝細胞を用いてCYPの誘導を調べた。CYPとしてin vivo実験で誘導が確認されていないが肝における発現量が多く代謝的薬物間相互作用にしばしば関与することが知られているCYP3A2/4、およびin vivo実験で4-MeMBIによる強い誘導が認められるCYP1A1/2を選択した。ラットまたはヒトの肝細胞を4-MeMBI、5-MeMBIまたはMBIの存在下で48または96時間培養し、HPLC法を用いてtestosteroneの6β-ハイドロキシ化の測定によるCYP3A2/4活性、および7-ethoxyresorufinのO-脱エチル化の測定によるCYP1A1/2活性を調べた。 ラット肝細胞では、4-MeMBIおよび5-MeMBIはCYP3A2を阻害したが、4-MeMBIがCYP1A1/2を強く誘導した。MBIはCYP3A2を強く阻害し、CYP1A1/2を弱く阻害した。これらの結果には、報告されているin vivoの実験結果とは矛盾が認められず、4(5)-MeMBIの毒性に関する代謝的薬物間相互作用には、4-MeMBIおよび5-MeMBIを代謝するCYP1A1/2の4-MeMBIによる誘導が重要であると考えられた。 ヒト肝細胞では、ドナーに依存して、4-MeMBIおよび5-MeMBIによるCYP1AおよびCYP3A4の弱い誘導が認められた。これらの結果から、ヒトにおいては4(5)-MeMBIの毒性に関する代謝的薬物間相互作用が起きる可能性は低いことが示唆された。（Miyajima A *, Kuroda Y *, Sakemi-Hoshikawa K, Usami M, Mitsunaga K, Irie T, Ohno Y, Sunouchi M. Inhibitory and inductive effects of 4- or 5-methyl-2-mercaptobenzimidazole, thyrotoxic and hepatotoxic rubber antioxidants, on several forms of cytochrome P450 in primary cultured rat and human hepatocytes. Toxicology Reports. 2020. * These authors equally contributed to this work.）5．ラット肝細胞における4-MeMBIおよび5-MeMBIのCYP mRNA誘導作用 mRNAレベルでCYP誘導効果を検討するために、4-MeMBIおよび5-MeMBIを8日間連続経口投与したラットにおけるCYP mRNAの変化率をCompetitive RT-PCR法を用いて調べた。その結果、4-MeMBIおよび5-MeMBIはCYPs 1A2、2B2、2C11、2E1および3A2のmRNA発現を誘導した。特にCYP1A2の誘導が大きく、4-MeMBIによる誘導量は5-MeMBIによる誘導量の８倍高かった。逆に、CYP2B2の誘導量は、5-MeMBIが4-MeMBIの２倍高かった。これらの結果から、in vivo実験およびin vitro実験における、CYPの活性増加は、mRNAのレベルでの発現誘導によると考えられた。（Yukie Kuroda*, Atsuko Miyajima*, Kazue Sakemi-Hoshikawa, Makoto Usami, Katsuyoshi Mitsunaga, Yasuo Ohno, and Momoko Sunouchi. Inducibility of cytochrome P450 (CYP) mRNAs by 4- or 5-methyl-2-mercaptobenzimidazole in the rat liver after repeated oral administration. ResearchGate. 2020. * These authors equally contributed to this work.）6．総括 本研究では、in vitro実験系を用いて、4-MeMBIおよび5-MeMBIの細胞毒性、肝CYPによる代謝、そして肝CYPの誘導を調べた。その結果、4-MeMBI、5-MeMBIおよびMBIの細胞毒性の強さはMethyl-MBIs ＞ MBIだった。これはin vivoで報告されている毒性とは逆だった。4-MeMBIおよび5-MeMBIは、CYPs 1Aおよび2Bにより代謝されること、CYP1A活性を誘導することを示した。さらに、4-MeMBIおよび5-MeMBIによるCYPsの活性誘導はmRNAレベルでの発現誘導であることを示した。これらの結果から、4-MeMBIおよび5-MeMBIは、混合物4(5)-MeMBIとして用いられた場合に、肝CYPの発現誘導によりお互いの代謝を促進することにより甲状腺毒性および肝毒性を弱める、という代謝的薬物間相互作用を起こすと考えられた。これは、強い毒性を持つ化学物質を混合物として用いた場合には、代謝的薬物間相互作用により毒性を弱める、という有用な現象である。; 1.IntroductionThe toxicity of chemical substances is greatly affected by their metabolism in the body. That is, chemical substances undergo detoxification, which weakens their toxicity, or activation, which increases their toxicity, when they are metabolized. On the other hand, cytochrome P450 (CYP), the enzyme that is quantitatively most abundant in the liver and is involved in the metabolism of many kinds of chemicals due to its low substrate specificity, can be induced or inhibited by chemicals. If the induced or inhibited CYPs are involved in the metabolism of other chemicals, a metabolic drug-drug interaction may occur in which the toxicity of the chemicals are affected. Therefore, toxicological evaluation of chemical substances should consider the effects of inducing or inhibiting CYPs and metabolic drug-drug interactions. However, currently there is no uniform method for evaluating metabolic drug-drug interactions, it is necessary to study each chemical substance individually.Methylated-2-mercaptobenzimidazole in this study refers to 4-methyl-2-mercaptobenzimidazole (4-methyle-2-mercaptobenzimidazole, 4-MeMBI) and 5-methyl-2-mercaptobenzimidazole (5-methyle-2-mercaptobenzimidazole, 5-MeMBI), which are methylated derivatives of 2-mercaptobenzimidazole (2-mercaptobenzimidazole, MBI) at position 4 or 5. The industrially used 1:1 mixture of 4-MeMBI and 5-MeMBI is abbreviated as 4(5)-MeMBI, and when these methylated MBIs are collectively referred to as Methyl-MBIs.4(5)-MeMBI and MBI are widely used industrially as anti-aging agents for rubber and are known to be environmental pollutants with low biodegradability. Therefore, various toxicological studies have been carried out due to concerns about their effects on human health.By using rats, Methyl-MBIs and MBIs have been shown to have strong thyroid toxicity due to their thiourea structure. In repeated and single-dose oral administration studies in rats, the toxicity of 4(5)-MeMBI was weaker than that of MBI, and the peroxidase inhibitory activity, which indicates thyroid toxicity, was also weaker for 4- and 5-MeMBI than for MBI. 4-MeMBI was the weakest in these. Toxicity test using thyroid weight as an indicator showed weaker toxicity with the mixture 4(5)-MeMBI than with 5-MeMBI alone, suggesting that the toxicity may have been attenuated by the interaction of the test compounds in the mixture. On the other hand, no difference was observed between 4-MeMBI or 5-MeMBI and 4(5)-MeMBI in hepatotoxicity as an indicator of hepatomegaly, which was thought to be related to their effects in the liver. In a report on the effects of repeated administration on the activity and protein levels of hepatic CYPs, 4-MeMBI and 5-MeMBI strongly induced CYP1A and CYP2B, respectively, but 4(5)-MeMBI had no additive effects on 4-MeMBI and 5-MeMBI. Although these reports suggest that the relatively low toxicity of 4(5)-MeMBI is due to metabolic drug-drug interactions between 4-MeMBI and 5-MeMBI via CYP induction or inhibition, there is currently no uniform method of evaluation, so individual chemicals need to be studied. In this study, we aimed to clarify the metabolic drug-drug interactions induced by 4-MeMBI and 5-MeMBI. We investigated the cytotoxicity of Methyl-MBIs and MBIs using the rabbit cornea-derived cell line SIRC cells. Then, metabolism by CYPs and induction of CYPs were examined for 4-MeMBI and 5-MeMBI by in vitro assays using rat liver microsomes and primary cultured rat and human hepatocytes. These in vitro assays are expected to provide results that are easier to analyze and evaluate than in vivo tests.2.Cytotoxicity of 4-methyl- and 5-methyl-2-mercaptobenzimidazole in SIRC cellsThe cytotoxicity of MBI and Methyl-MBIs in SIRC were detected by the crystal violet staining assay. The half lethal concentration (LC50) was calculated from cell viability, and the intensity of cytotoxicity was found to be 5-MeMBI ≥ 4-MeMBI ≥ 4(5)-MeMBI > MBI. Methyl-MBIs showed similar cytotoxicity and were more potent than MBIs, suggesting that the presence of a methyl group on the benzene ring increases the cytotoxicity of MBI derivatives. In addition, SIRC cells have low drug-metabolizing enzyme activity, supporting the hypothesis that the low thyroid toxicity and hepatotoxicity of Methyl-MBIs in vivo are due to the induction of drug-metabolizing enzymes.3.Metabolism of 4-MeMBI, 5-MeMBI and MBI in rat liverThe metabolism of 4-MeMBI, 5-MeMBI, and MBI by CYP in rat liver microsomes was investigated by HPLC method. The results showed that 4-MeMBI, 5-MeMBI, and MBI were metabolized by CYPs in a time-dependent manner. From the metabolic assay using liver microsomes treated with β-naphthoflavone, a CYP1A inducer, phenobarbital, a CYP2B inducer, and isoniazid, a CYP2E inducer, showed that 4-MeMBI and 5-MeMBI were metabolized by CYPs-dependent manner. CYPs 1A and 2B were involved in the metabolism of 4-MBI and 5-MeMBI, and both were more dependent on CYP2B. These results and the results of reported in vivo experiments suggest a metabolic drug-drug interaction in the metabolism of 4(5)-MeMBI, in which 5-MeMBI and 4-MeMBI are efficiently metabolized by CYP1A induced by 4-MeMBI and CYP2B induced by 5-MeMBI, respectively. 4.Effect of 4-MeMBI, 5-MeMBI and MBI on CYP activity in rats and human primary cultured hepatocytesTo further investigate the metabolic drug-drug interactions in 4(5)-MeMBI by induction of CYPs, we evaluated the induction of CYPs in primary cultured rat and human hepatocytes. As selected CYPs of CYP3A2/4 induction has not been confirmed in vivo tests but is known to be frequently involved in metabolic drug-drug interactions, and that of CYP1A1/2, which were strongly induced by 4-MeMBI in in vivo tests. Rat or human hepatocytes were cultured for 48 or 96 hours in the presence of 4-MeMBI, 5-MeMBI, or MBI. And then, the activity of CYP3A2/4 activity was determined by measuring 6β-hydroxylation of testosterone and that of CYP1A by CYP1A1/2 activity by measuring O-deethylation of 7-ethoxyresorufin using the HPLC method.In rat hepatocytes, 4-MeMBI and 5-MeMBI inhibited CYP3A2, while 4-MeMBI strongly induced CYP1A1/2. MBI strongly inhibited CYP3A2 and weakly inhibited CYP1A1/2. These results were consistent with the reported in vivo tests results, suggesting that the induction by 4-MeMBI of CYP1A1/2, which metabolizes 4-MeMBI and 5-MeMBI, is important for the metabolic drug-drug interaction regarding the toxicity of 4(5)-MeMBI.In human hepatocytes, weak induction of CYP1A and CYP3A4 by 4-MeMBI and 5-MeMBI was observed in a donor-dependent manner. These results suggest that metabolic drug-drug interactions related to the toxicity of 4(5)-MeMBI are unlikely to occur in humans.5.Induction of CYPs mRNA by 4-MeMBI and 5-MeMBI in rat hepatocytes (additional data)To investigate the effect of CYPs induction at the mRNA level, the rate of change of CYPs mRNA in rat’s oral administration with 4-MeMBI and 5-MeMBI for 8 consecutive days was evaluated using the Competitive RT-PCR. The results showed that 4-MeMBI and 5-MeMBI induced the mRNA expression of CYPs 1A2, 2B2, 2C11, 2E1, and 3A2. The induction of CYP1A2 was particularly large, and the amount of induction by 4-MeMBI was eight times higher than that by 5-MeMBI. Conversely, the induction of CYP2B2 by 5-MeMBI was 2-fold higher than that by 4-MeMBI. These results suggest that the increased activity of CYPs in in vivo and in vitro experiments is due to the induction of expression at the mRNA level.6.ConclusionIn this study, we investigated the cytotoxicity of 4-MeMBI and 5-MeMBI, their metabolism by CYPs, and their induction of CYPs in liver using in vitro assays. The results showed that the strength of cytotoxicity of 4-MeMBI, 5-MeMBI and MBI was Methyl-MBIs > MBI which is opposite to the toxicity reported in vivo. 4-MeMBI and 5-MeMBI were shown to be metabolized by CYPs 1A and 2B and to induce CYP1A activity. Furthermore, we showed that the induction of CYPs activity by 4-MeMBI and 5-MeMBI was the mRNA level. These results suggest that 4-MeMBI and 5-MeMBI, when used as a mixture 4(5)-MeMBI, cause a metabolic drug-drug interaction that weakens thyroid toxicity and hepatotoxicity by promoting each other's metabolism through induction of CYPs. This is a useful phenomenon in that when highly toxic chemicals are used as a mixture, the toxicity is weakened by the metabolic drug-drug interaction of these chemicals.
• Persistent ID (NDL): info:ndljp/pid/12071017; https://dl.ndl.go.jp/pid/12071017
• Collection: 障害者向け資料
• Collection (Materials For Handicapped People:1): テキストデータ
• Collection (particular): 国立国会図書館デジタルコレクション > デジタル化資料 > 博士論文; https://dl.ndl.go.jp/collections/A00014
• Acquisition Basis: 博士論文（自動収集）
• Date Accepted (W3CDTF): 2022-02-06T04:33:19+09:00
• Date Created (W3CDTF): 2022-01-19
• Format (IMT): PDF
• Access Restrictions: 国立国会図書館内限定公開
• Service for the Digitized Contents Transmission Service: 図書館・個人送信対象外
• Availability of remote photoduplication service: 可
• Periodical Title (URI): http://id.nii.ac.jp/1112/00005408/
• Data Provider (Database): 国立国会図書館 : 国立国会図書館デジタルコレクション; https://dl.ndl.go.jp