【研究の背景】日本国内での稀な毒蛇咬傷例として、やまかがしのそれがある。やまかがし咬傷には重篤例もあるが、発生が少ないことから治療薬の開発は進まず、医薬品として承認された治療用の抗毒素は存在しない。そこで今回、やまかがし咬傷に視点を当て、治療薬としてのやまかがしウマ抗毒素を試験的に製造することを目的として研究を実施した。やまかがし抗毒素は、過去には家兎および山羊を免疫用動物として作製されている。これらの製剤は、緊急措置の治療に用いられ、その有効性が認められていた。しかしながら、これらの抗毒素は既に枯渇し、現在は存在しない。今回、ウマを免疫用動物として初めて用いて、やまかがし抗毒素の試験的な製造を試みた。この新しい抗毒素は、緊急時の健康危機管理の観点から臨床研究の位置付けでの超法規的な使用を前提として備蓄されるものとなる。【第1章】やまかがしウマ抗毒素の作製やまかがし抗毒素のウマを用いた初めての試験製造について述べた。約500匹のやまかがしから、毒素11gを採取し、2頭のウマにやまかがし毒の免疫を行った。抗毒素価の上昇を待って血清を採集し、市販のウマ抗毒素製剤に準拠した方法で免疫グロブリン画分を精製した。その後、至適条件下で凍結乾燥させ、治療用の「乾燥やまかがしウマ抗毒素(Lot 0001)」1,369本を2000年に作製した。製剤の品質試験として実施した純度試験では、製剤中に免疫グロブリン(γ-グロブリンとT-グロブリン)のみが含まれることが確認された。力価試験では、製剤1本が約13mgのやまかがし毒を中和することが確認された。抗凝固活性の定量試験では、製剤1本中に約4mgのやまかがし毒を中和する活性を含むことが確認された。また、その他の一般性状試験では、当製剤が市販のその他のウマ抗毒素製剤と同等の品質であることが確かめられた。故に、このやまかがしウマ抗毒素は咬傷患者の救命に必須の治療薬になり得る。【第2章】 やまかがしウマ抗毒素の安定性評価作製日から長期経過した、やまかがしウマ抗毒素(Lot 0001)の品質保持について述べた。2021年にはやまかがしウマ抗毒素(Lot 0001)が、作製日から21年を経過する。このことから、長期間保存による製剤への影響を確認するため、経時的に品質試験を行った。その結果、性状確認試験、不溶性異物試験、浸透圧比試験、pH試験、たん白質含量試験、エンドトキシン試験および無菌試験については、製造直後の成績と比較して、2020年12月時点で変化を認めなかった。含湿度については、製造直後に比べて2020年では若干の上昇傾向がみられたが、上昇後でも規格内の低い値であった。製剤の異常毒性否定試験および発熱試験においても、長期間保存による変化は認められなかった。製剤の力価試験についても、製造直後の力価が2020年において保持されていた。以上の成績から、やまかがしウマ抗毒素(Lot 0001)は、製造から21年が経過した現時点でも製剤として有効であると考えた。【第3章】 やまかがしウマ抗毒素の臨床評価事例やまかがしウマ抗毒素(Lot 0001)が、緊急事態として発生したヒトやまかがし咬傷の重症例において使用された例ついて述べた。2000年の試験製造以降、2001年から2011年の間に2例の重篤なやまかがし咬傷患者に緊急避難的に当製剤が使用された。また、2017年に発生した2例のやまかがし重症患者に対しても当製剤が使用された。その結果、すべての症例で治療は成功し、顕著な副反応もみられなかった。以上のように、やまかがしウマ抗毒素(Lot 0001)が患者の救命に寄与したことが確認された。2017年の咬傷事例では、この時点で抗毒素は製造から既に17年が経過していたにもかかわらず、顕著な有効性が認められた。2017年の治療例は製剤の長期保存後の品質安定性の事実を支持する事例である。本研究の結論は次のとおりである。1）やまかがし毒を免疫用抗原として用いて、国内初の「やまかがしウマ抗毒素(Lot 0001)」の1,369本を試験製造した。本研究はやまかがしウマ抗毒素の作製について初めて示したものである。2）やまかがしウマ抗毒素(Lot 0001)は、承認薬である他の抗毒素と同様に人用製剤としての品質を保有することが確認された。また、製剤1本は4mg以上のやまかがし毒を中和することが分かった。3）やまかがしウマ抗毒素(Lot 0001)が、製造から21年を経過した2021年現在でも、概して、製造直後の品質を保持することが分かった。ウマ抗毒素が20年もの長期間保存出来る事実が本研究により初めて示された。4）2000年の試験製造以降17年が経過したやまかがしウマ抗毒素(Lot 0001)が、やまかがし咬傷重篤患者に有効である事実が初めて示された。以上のように、本研究の成果は、人命救助および日本の医療や蛇毒抗毒素療法の発展に貢献したものであり、本研究の社会的意義は大きいと考える。本研究の一部は、以下の学術論文に公表済みである。1． Morokuma, K., Kobori, N., Fukuda, T., Uchida, T., Sakai, A., Toriba, M., Ohkuma, K., Nakai, K., Kurata, T. and Takahashi, M.: Experimental manufacture of equine antivenom againt Yamakagashi (Rhabdophis tigrinus). Jpn. J. Infect. Dis., 64, 397-402, 2011.(https://www.niid.go.jp/niid/JJID/64/397.pdf.)2． Morokuma, K., Matsumura, T., Yamamoto, A., Sakai, A., Hifumi, T., Ato, M. and Takahashi, M.: Evaluation of the stability of Yamakagashi (Rhabdophis tigrinus) Equine Antivenom after 20 years storage. Tropical Biomedicine, 38, 111-118, 2021.(https://secureservercdn.net/72.167.241.180/114.7f7.myftpupload.com/files/Vol38No2/tb-38-2-042-Morokuma-K.pdf)
Bites by Yamakagashi, Rhabdophis tigrinus are rare in Japan. Although there are serious cases of R. tigrinus bites, the incidence is extremely low. Thus, development of therapeutic drugs commercially has not progressed, and no therapeutic antivenom has been approved as a pharmaceutical drug. We conducted a study with the primary objective of experimentally manufacturing the Yamakagashi equine antivenom as a therapeutic drug. In the past, antivenom against R. tigrinus was experimentally manufactured using rabbits and goats as animals for immunization. It has been reported that these antivenom were used for treatment as an emergency measure and was found to be effective. However, this antivenom has already been used up and no longer available. In this study, we produced a new lot of Yamakagashi antivenom using horses for the first time as immunization animals. This new antivenom was stockpiled on the premise of extrajudicial use in clinical research from the viewpoint of emergency health risk management. This thesis consists of three chapters, in which the development, storage and application of the Equine antivenom against Yamakagashi (R. tigrinus) are described. In Chapter 1, we described the new test-production of Yamakagashi equine antivenom. 11 g of Yamakagashi venom was extracted from about 500 heads of R. tigrinus, and two horses were immunized with the venom. Serum was collected after waiting for the antivenom titer to increase, and immunoglobulins were fractionated and purified by a method compliant with commercially available equine antivenom products. This was followed by lyophilization to produce 1,369 vials of "Freeze-dried Yamakagashi Antivenom, Equine (Lot 0001)" for therapeutic use in 2000. A purity test conducted as a quality control test of this product confirmed that only immunoglobulins (γ-globulin and T-globulin) were contained in the product. A potency test confirmed that one vial of the product neutralized about 13 mg of R. tigrinus venom. Quantitative testing of anticoagulant activity confirmed that each vial of the product could neutralize the activity of about 4 mg of R. tigrinus venom. Other general tests confirmed that this product is comparable in quality to other horse antivenom products on the market. This Yamakagashi equine antivenom can be an indispensable therapeutic drug to save the life of bite patients by R. tigrinus. In Chapter 2, we described the quality retention of the "Freeze-dried Yamakagashi Antivenom, Equine (Lot 0001)" after a long period of time from the date of production. In 2021, twenty-one years has passed since the Yamakagashi equine antivenom (Lot 0001) has been manufactured. Therefore, quality control tests were conducted over time to confirm the effect of long-term storage on this product. As a result, no particular changes were observed in the physical and chemical tests (property test including dissolution time, insoluble foreign matter test, osmotic pressure ratio test, test of pH, test for protein content, endotoxin test, and sterility test) as of December 2020, as compared to the results immediately after test-manufacturing. Although the moisture content tend to increase after manufacturing, it was still much lower than the specified level, and thus conformed to the test. No changes were observed in test for freedom from abnormal toxicity and pyrogen test of the product after long-term storage. The potency test (anticoagulant activity) of the product also showed that the potency immediately after manufacture was sufficiently maintained in 2020. Based on the above results, we considered that Yamakagashi equine antivenom (Lot 0001) is still effective as a therapeutic drug even at 21 years after its production. In Chapter 3, we summarized the cases in which the "Freeze-dried Yamakagashi Antivenom, Equine (Lot 0001)", as described in Chapter 1, was used in emergency situation in severe Yamakagashi bite patients. Since its test-production in 2000, the Yamakagashi equine antivenom has been used as an emergency drug in two serious cases of R. tigrinus bites in 2001 and 2011. Also, this product was used in two cases of severe Yamakagashi bite that occurred in 2017. As a result, these treatments with antivenom were successful in all cases, with no significant adverse reactions. As described above, it was confirmed that the Yamakagashi equine antivenom (Lot 0001) contributed to saving the patient's life. In the 2017 bite case, the antivenom was found to be remarkably effective, even though the product had already been test-manufactured 17 years ago. The 2017 therapeutic cases proved the retention of the quality stability after long-term storage of the product. The conclusions of this study are as follows.1)1,369 vials of Yamakagashi equine antivenom (Lot 0001) were test-manufactured for the first time in Japan, using R. tigrinus venom as an antigen for immunization. This study is the first to demonstrate the production of Yamakagashi equine antivenom.2)Yamakagashi equine antivenom (Lot 0001) was found to possess the same quality as other approved antitoxins for human use. In addition, one vial of the product was found to neutralize more than 4 mg of R. tigrinus venom.3)Yamakagashi equine antivenom (Lot 0001) was found to generally retain its immediate post-production quality even in 2021, that is, 21 years after production. This equine antivenom could be stored for as long as 20 years was demonstrated for the first time.4)Seventeen years after its test-production in 2000, the Yamakagashi equine antivenom (Lot 0001) was shown to be still effective in patients with severe cases of R. tigrinus bites, and thus demonstrating its life-saving efficacy. As described above, the results of this study have contributed to the saving of lives and the development of medical care and snake antivenom therapy in Japan. The contribution of our study to science and society is deemed to be significant.