プリオン病の神経変性機構の解析および治療薬の開発に向けた基礎的研究

• Material Type: 博士論文
• Title: プリオン病の神経変性機構の解析および治療薬の開発に向けた基礎的研究
• Author/Editor: 清水, 琢音
• Author Heading: 清水, 琢音
• Publication Date: 2023-03-15
• Publication Date (W3CDTF): 2023-03-15
• Alternative Title: Analysis of neurodegenerative mechanisms of prion disease and basic research for the development of therapeutic agents
• Degree grantor/type: 麻布大学
• Date Granted: 2023-03-15
• Date Granted (W3CDTF): 2023-03-15
• Dissertation Number: 甲第173号
• Degree Type: 博士(獣医学)
• Text Language Code: jpn
• Target Audience: 一般
• Note (General): ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病 (CJD)、ヒツジやヤギにおけるスクレイピー、ウシにおける牛海綿状脳症を含み、伝達性海綿状脳症としても知られるプリオン病は、正常プリオンタンパク質 (PrPC) が何らかの要因で伝達性を有する異常プリオンタンパク質 (PrPSc) に高次構造変換し、中枢神経に蓄積することによって引き起こされる神経変性疾患である。致死性の疾患でありかつ人獣共通感染症でもあることから、医学領域および獣医学領域の双方において重要な疾患である。ヒトにおけるプリオン病は発症機序から、原因不明の孤発性/特発性、PrPをコードする遺伝子の変異に起因した遺伝性、外部からのPrPScの伝播による獲得性 (感染性) に大別される。病因タンパク質であるPrPは動物種を超えアミノ酸配列が保存された糖タンパク質であり、中枢神経系や末梢神経系で高発現する。プリオン病の神経変性機構の解明を目的として、PrPの正常な機能の解析が進み、細胞内シグナル伝達や酸化ストレスの制御に関与していることが明らかとなった。しかしながら高次構造変換を通したPrPの生理的な機能の喪失、もしくは新たな機能の獲得のいずれが神経変性の要因となり得るのかということを含め、プリオン病の神経変性機構は詳細が明らかでない。また、前述のとおりプリオン病はPrPの高次構造変換によって惹起されることから、PrPScの産生阻害と分解の亢進を標的とした化合物が治療薬として検討されてきたものの、病気の進行につれてこれらの薬剤に耐性を持ったプリオン株の発生が薬剤の効果が減弱させ、今日において臨床的に十分な効果が得られた治療薬が存在しない。そこで本研究では、PrPの神経変性機構の解析ならびに新規治療薬の創出に向けた基礎的研究を行った。【第一章：プリオン病におけるプリオンタンパク質のミトコンドリアへの標的化と神経変性機構の解析】細胞が機能を維持するためには1万種を超えるタンパク質が合成され、必要とされる特定の細胞区画に局在する必要がある。タンパク質の細胞内における異所性の局在は細胞機能に影響を及ぼし、様々な疾患の発症要因となることが知られている。PrPはアミノ末端側に小胞体移行配列、カルボキシ末端側にGPIアンカー付加配列を有する分泌系のタンパク質であり、細胞膜上に局在する。一方でPrPが典型的な分泌系のタンパク質としての特徴を持つにも関わらず、PrPを強制発現させた老齢のトランスジェニックマウスにおけるプロテアソーム活性の低下や遺伝性プリオン病を引き起こすPrPの遺伝的な変異はPrPをミトコンドリアに異所性に標的化させ、細胞死を引き起こすことが報告されている。しかしながらPrPがいかにしてミトコンドリアに局在し、神経変性を起こしうるのかについては、詳細が明らかでない。そこで第一章では、PrPのアミノ酸配列中のミトコンドリア局在配列およびミトコンドリアへの標的化に関与する因子の同定を通じて、PrPのミトコンドリアへの標的化機構を明らかとすることを目的とした。さらにPrPのミトコンドリアへの標的化系の構築を通じて、PrPのミトコンドリアへの局在が細胞機能へ及ぼす影響を観察した。GFPを融合させた様々な長さのPrPのトランケート発現ベクターを構築し、蛍光顕微鏡を用いてPrPの細胞内局在を観察したところ、全長のアミノ酸のトランケートは細胞膜とゴルジ体に局在した。121番目までのトランケートPrPは細胞質に局在した一方で139番目までのトランケートPrPは発現した全てのPrPがミトコンドリアに局在した。このことから、PrPのアミノ酸配列上の122番目から139番目までの18アミノ酸がミトコンドリア局在配列として機能することを見出した。このときPrPが局在したミトコンドリアは、非神経細胞では正常な細胞内分布を保っていた一方で、神経細胞では正常な細胞内分布を失い、核の周囲に集積していた。また、神経細胞と非神経細胞のミトコンドリアサブコンパートメントの分画を行い、PrPの局在をウェスタンブロットによって検出したところ、PrPは非神経細胞では膜間腔ならびに内膜近傍画分に局在していたのに対し、神経細胞では膜間腔ならびに内膜近傍に加えて、外膜画分にも局在していた。さらにタンパク質のミトコンドリアへの局在には細胞質の因子が必須であることが報告されていることを踏まえ、ミトコンドリア前駆タンパク質の輸入促進効果を有することが知られ、プリオン病の診断マーカーとしても用いられる14-3-3タンパク質について、PrPのミトコンドリアへの局在に及ぼす影響をRNA干渉を用いた実験系によって検討したところ、14-3-3γならびにηの発現阻害はPrPのミトコンドリアへの局在を阻害した。さらに14-3-3ζの発現阻害は、PrPのミトコンドリアへの局在に影響を及ぼさないものの、ミトコンドリアの細胞内分布を正常化させた。またPrPを認識するミトコンドリア外膜上の受容体として、ミトコンドリア前駆タンパク質のミトコンドリア内部への中心的な搬入孔として機能するTOM複合体との関与を同様のRNA干渉を用いた実験系にて検討したところ、Tom70の発現阻害はPrPのミトコンドリアへの局在を阻害した。 以上の結果から、PrPは122番目から139番目の18アミノ酸、14-3-3γならびにη、Tom70を介してミトコンドリアに標的化すること、神経細胞特異的にミトコンドリア外膜上に局在したPrPは14-3-3ζ依存的にミトコンドリアの細胞内分布を破綻させ、ミトコンドリアを核周囲に集積させることを明らかとした。神経細胞において軸索はシグナル伝達等で多量のATPを要求することから、軸索末端のミトコンドリア供給不全は軸索の退縮を惹起し、プリオン病の急速な神経変性の要因となり得ることが示唆された。【第二章: 吸入麻酔薬前駆体ヘキサフルオロ-2-プロパノールのプリオン病治療薬への応用に向けた基礎的研究】 前述のとおり、プリオン病はPrPCがPrPScへと高次構造変換することで発症が惹起されると考えられている。第一章で見出されたミトコンドリア局在配列であるPrP (122-139) 中の138および139番目のアミノ酸も遺伝性プリオン病におけるPrPの線維形成に重要な役割を担うことが報告されており、PrPのミトコンドリアへの異所性の局在とPrPの高次構造変換の関与が考えられる。PrPScの産生阻害を目的とした様々な薬剤がプリオン病治療薬として検討されてきた一方で、薬剤の継続的な添加は薬剤耐性を持ったプリオン株の産生をもたらし、臨床的に十分な効果が得られた薬剤が存在しない。フルオロアルコールであるヘキサフルオロ-2-プロパノール (HFIP: Hexafluoro-2-propanol) は吸入麻酔薬であるセボフルランの前駆体である。HFIPをはじめとしたフルオロアルコールは、タンパク質のβ-シート構造を破壊してα-ヘリックス構造を誘導する性質を持つことから、タンパク質溶液中の分子間相互作用の変化をもたらしエフェクター分子として機能することが知られている。この性質から、HFIPはAmyloid β (Aβ) ペプチドのようなペプチド凝集体を溶解する溶媒として用いられている。上述のとおり従来検討されてきた多くの薬剤は薬剤耐性を持ったプリオン株の発生が問題であった。一方でHFIPは強固なα-ヘリックス誘導活性を持つため、PrPScをPrPCへと誘導しPrPScの構造を正常化することが可能と考えられる。したがって従来検討されてきた化合物の問題点であった薬剤耐性プリオン株の発生という問題点を解決することが期待される。以上を踏まえて第二章では、組換えタンパク質より作製したPrP線維およびプリオン病のin vitroのモデルとして確立されているスクレイピー持続感染マウス神経芽細胞腫由来細胞株 (ScN2a細胞) を用いて、HFIPのプリオン病治療薬への応用に向けた基礎的検討を実施した。 組換えタンパク質より作製したPrP線維を用いてHFIPの添加が線維構造に及ぼす影響を透過型電子顕微鏡を用いて観察したところ、10 mMのHFIPの添加はPrPの線維構造を分岐した三叉の構造に変化させた。さらに20 mMのHFIPの添加はPrPの線維構造を完全に消失させ、規則構造を持たないアモルファス様の凝集体を形成させた。一方でAβ (1-40) 線維へのHFIPの添加は線維構造を変化させないものの、濃度依存的に線維どうしの会合を促進させた。また、HFIPの添加がタンパク質の二次構造に及ぼす影響を円偏光二色性スペクトルの測定によって推定したところ、HFIPはAβ (1-40) と比較してPrPに対して強いα-ヘリックス誘導活性を有することが示唆された。さらにPrPScを持続産生するScN2a細胞にHFIPを添加し、PrPScの生化学的特徴であるプロテアーゼに対する抵抗性をウェスタンブロットを用いて検出したところ、15 mM以上のHFIPの添加はPrPのプロテアーゼ抵抗性を有意に減弱させた。このとき、HFIPはPrPの細胞内局在ならびにミトコンドリアの膜電位に影響を及ぼさなかった。最後にHFIPの細胞毒性を評価したところ、HFIPはN2a細胞と比較してScN2a細胞に対して高い毒性を示した。以上の結果から、HFIPのPrP線維に対する強いα-ヘリックス誘導活性ならびにPrPScを有する細胞への強い細胞毒性を見出した。治療域の狭さや、PrPに対する特異性の問題など、治療薬としての実用化に向けて課題があるものの、HFIPを含めたフッ素化合物がプリオン病治療薬となり得る可能性が示唆された。; Prion diseases are a group of fatal neurodegenerative disorders affecting numerous mammalian species, including humans. Human prion diseases are mainly classified into three types, sporadic Creutzfeldt-Jacob Disease (sCJD), genetical prion disease in which a gene encoding Prion protein (PrP) in mutated such as Gerstmann-Sträussler-Scheinker or Fatal Familial Insomnia, and variant CJD caused by ingestion of food contaminated with bovine prion disease (bovine spongiform encephalopathy: BSE). Among these diseases, sCJD is most prevalent, accounting for more than 80% of patients and affects 1 to 1.5 people per million.Prion diseases are fundamentally caused by a conformational change of the responsible protein, the prion protein, from its cellular isoform (PrPC) to its diseaseassociated isoform (PrPSc). PrP is a secretory protein with an endoplasmic reticulum (ER) targeting signal at the amino-terminal end and a GPI-anchor signal end to a lipid rafts on the cell membrane at carboxy-terminal end. In addition, PrP localized on plasma membrane is taken up by endocytosis and undergoes degradation by degrading enzymes in lysosomes. To elucidate the neurodegenerative mechanisms of prion diseases, the physiological functions of PrP were analyzed and found to be involved in intracellular signaling, regulation of oxidative stress, and circadian rhythm. However, the mechanism of neurodegeneration in prion diseases remains unclear, including whether the loss of normal physiological functions due to structural changes or acquisition of novel functions for PrP. In addition, as a therapeutic agent for prion diseases, attempts have also been made to identify compounds that inhibit the structural conversion PrPC to PrPSc and induce degradation of PrPSc. However, many of these drugs have resulted in drug resistant of prion strains. Because these problems remain, the development of clinically satisfactory therapeutics continues. In Chapter 1, to elucidate the neurodegenerative mechanism of prion disease, considering the ectopiclocalization of pathogenic proteins to mitochondria has been reported to be involved in the pathogenesis of neurodegenerative disease, the mechanism of ectopic localization of PrP to mitochondria was conducted. In Chapter 2, conducted a basic study of hexafluoro-2-propanol (HFIP), which has been reported to possess strong α -helix-inducing activity for the development of new therapeutic agents of prion disease.Chapter 1: Analysis of the mechanism of prion protein targeting to mitochondria and neurodegeneration in prion diseases In many neurodegenerative diseases, mitochondria are actively involved in the onset and/or progression of diseases because the energy depletion of the neuronal cells directly leads to the dysfunction and degeneration of cells. Recently, it has been reported that ectopic localization of pathogenic proteins of neurodegenerative diseases to mitochondria can be a factor in disease and genetic mutations in the PrP gene has also reported to localize PrP to mitochondria and cause neurodegeneration. In addition, it has been also reported that PrP is localized to mitochondria in healthy mouse. Despite these findings, the precise mechanism of how PrP, a secretory protein, is targeted to mitochondria is not well understood. In Chapter 1, we used cultured cells to analyze the mechanism of PrP targeting mitochondria and its physiological importance in detail, including mitochondrial localization sequences on the amino acid sequence of PrP and receptors on the mitochondrial outer membrane. To clarify the amino acid sequence responsible for the mitochondrial targeting of PrP, we have constructed various truncated forms of mouse PrP fusing GFP and observed intercellular localization of PrP. Consequently, the 18 amino acids at positions 122-139 around the molecule's middle were discovered to be critical for targeting PrP to mitochondria. Even when PrP was localized, the subcellular distribution of mitochondria in HeLa cells was normal. In N2a cells, however, mitochondria formed perinuclear aggregates and there was no distribution near the cell terminus. PrP was found in the intermembranous lumen or near the inner membrane of mitochondria in HeLa cells, but not in N2a cells, where it was found in the outer membrane as well as the intermembranous lumen and near the inner membrane. The mitochondrial outer membrane protein Tom70 and cytoplasmic the gamma and eta isoform of 14-3-3 proteins were required for PrP mitochondrial targeting. In addition, the zeta isoform of 14-3-3 protein was essential for the formation of mitochondrial perinuclear aggregates. These results suggested that PrP targets mitochondria via mitochondrial targeting sequence, gamma and eta isoforms of 14-3-3 proteins and Tom70. Neuron-specific localization of PrP at the mitochondrial outer membrane disrupts normal intracellular distribution of mitochondria in a zeta isoform of 14-3-3 protein-dependent manner. Since axons require large amounts of ATP for signaling, etc., it was suggested that a neuronspecific failure of mitochondrial supply at axon terminals may cause axonal degeneration and contribute to the neurodegeneration of prion diseases.Chapter 2: Fundamental study of the inhalant anesthetic precursor hexafluoro-2- propanol for use as a therapeutic agent for prion disease Prion diseases are thought to be triggered by the structural conversion of PrPC into PrPSc, which accumulates in the central nervous systems for some reason. Since the accumulation of PrPSc is the cause of prion disease, various drugs aimed at inhibiting the production of PrPSc have been investigated for the treatment of prion disease. However, the emergence of drug-resistant prion strains resulting from continuous drug administration has weakened therapeutic efficacy, and there are no clinically effective treatments available. Sevoflurane is a commonly used inhalation anesthetic with relatively fewer side effects than other inhalation anesthetics because it is not metabolized to acyl halides. The fluorinated alcohol hexafluoro-2-propanol (HFIP) is a precursor of sevoflurane. Fluorinated alcohols, such as HFIP, have a particularly strong proteindenaturing activity and break the β-sheet structure leading to α-helix. Therefore, it has been used as a solvent to dissolve peptide aggregates such as amyloid β (Aβ) peptides. Although attempts have been made to identify compounds that inhibit the structural conversion of PrPC to PrPSc as therapeutic agents for prion diseases, the problem with these agents, as mentioned above, is that continuous administration of these agents leads to the development of drug-resistant prion strains. On the other hand, HFIP has strong α-helix-inducing activity, should be able to unwind PrPSc into PrPC, and PrPSc structure itself will be normalized. In chapter 2, we explored the possibility of HFIP as a therapeutic drug for prion diseases using recombinant PrP and scrapie-infected mouse neuroblastoma cells, an established in vitro model of prion disease. Transmission electron microscopy of the morphology of PrP fibrils prepared from recombinant protein with HFIP revealed that the addition of 10 mM HFIP induced a branched, trifurcated fiber structure. Moreover, the addition of 20 mM HFIP completely transformed the fibrous PrP into an amorphous shape. Compared to PrP the Aβ (1-40) did not alter the fibrous structure in the presence of HFIP, but a rather enhanced association of the amyloid fibrils. The measurement of circular dichroism spectrum revealed that HFIP has stronger α-helix inducing activity against PrP than Aβ (1-40). When HFIP was added to ScN2a cells and protease resistance was detected, the addition of HFIP above 15 mM significantly attenuated the protease resistance of PrP. Furthermore, ScN2a cells showed significantly lower cell viability with the addition of HFIP compared to N2a cells.These results confirm the strong α-helix induction activity of HFIP against PrP and its strong cytotoxicity against cells with PrPSc. Although there are some issues for practical application as a therapeutic agent, such as a narrow safety margin and the substrate specificity of PrP, the mechanism of action of HFIP for induction of PrPSc to PrPC as a therapeutic agent for prion diseases is a novel approach that has not been developed so far, suggesting that fluorine compounds including HFIP may be a potential therapeutic agent for prion diseases.
• DOI: 10.14944/00005480; https://doi.org/10.14944/00005480
• Persistent ID (NDL): info:ndljp/pid/12911811; https://dl.ndl.go.jp/pid/12911811
• Collection: 障害者向け資料
• Collection (Materials For Handicapped People:1): テキストデータ
• Collection (particular): 国立国会図書館デジタルコレクション > デジタル化資料 > 博士論文; https://dl.ndl.go.jp/collections/A00014
• Acquisition Basis: 博士論文（自動収集）
• Date Accepted (W3CDTF): 2023-07-08T03:42:33+09:00
• Format (IMT): application/pdf
• Access Restrictions: 国立国会図書館内限定公開
• Service for the Digitized Contents Transmission Service: 図書館・個人送信対象外
• Availability of remote photoduplication service: 可
• Periodical Title (URI): http://dx.doi.org/10.14944/00005480; https://az.repo.nii.ac.jp/records/5514
• Data Provider (Database): 国立国会図書館 : 国立国会図書館デジタルコレクション; https://dl.ndl.go.jp

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