畜産物中に残留するアプラマイシンの定量方法開発に関する研究

• Material Type: 博士論文
• Title: 畜産物中に残留するアプラマイシンの定量方法開発に関する研究
• Author/Editor: 小笠原, 英城
• Author Heading: 小笠原, 英城
• Publication, Distribution, etc.: 三重大学
• Publication Date: 2023-03-24
• Publication Date (W3CDTF): 2023-03-24
• Alternative Title: Study on development of quantitative measuring method for residual apramycin in livestock products.
• Degree grantor/type: 三重大学
• Date Granted: 2023-03-24
• Date Granted (W3CDTF): 2023-03-24
• Dissertation Number: 甲学術第2197号
• Degree Type: 博士(学術)
• Text Language Code: jpn
• Target Audience: 一般
• Note (General): application/pdf; 本論文は、畜産物中に残留するアプラマイシン（AP）の定量測定方法開発を目的とした。AP はアミノグリコシド系抗生物質の一つであり、動物用医薬品として使用され、ポジティブリスト制度の導入により、残留基準値（MRL）が設定されている。畜産物中の AP 定量測定方法は、微生物試験方法が告示されているが、手順が非常に煩雑で、特異性や検出感度に課題がある。他にも液体クロマトグラフィー-タンデム型質量分析（LC-MS/MS）法が報告されているが、マトリックス添加検量線法による定量測定やイオンペア試薬の使用等、汎用的な分析方法ではない。また、脂肪組織に対する試験方法も報告されていない。そこで、畜産物中の残留 AP の定量測定について、試料調製方法、機器分析方法を検討した。本論文は 5 章から成る。 第 1 章は、本研究の背景や関連法令、LC-MS/MS などの概説、本研究の目的を述べた。 第 2 章は、畜産物中の AP を定量測定するための事前検討を行った結果について報告した。AP の定量測定を行うには、試料調製方法と AP を検出させる方法について検討する必要がある。まず、AP を検出させる方法として、すでに報告されている LC-MS/MS 条件を参考に、AP が検出されるか検討した。AP の検出が確認された後、より定量精度が高まるよう、分離カラムの比較検討やイオン化等の条件を検討した。試料調製方法は、AP について、微生物試験方法が告示されており、その試料調製方法が LC-MS/MS 法に適応できるか検討を行った。微生物試験法では、アルカリ加水分解抽出－イオン交換クロマトグラフィー精製法が用いられている。微生物試験では AP による微生物活性を評価する試験であるため、官能基の一部が分解されても測定結果への影響は少ない。しかし、AP を LC-MSMS法で定量測定するには、AP がアルカリ加水分解抽出で分解されないことを確認する必要がある。そこで AP をアルカリ加水分解し、液体クロマトグラフィー-オービトラップ型イオントラップ質量分析計（Orbitrap LC-MS）による精密質量測定と核磁気共鳴（NMR）分析装置による構造解析を行い、AP が分解されないことを確認した。また、微生物試験に準じた方法で牛試料（筋肉、脂肪、肝臓）を試料調製した際の夾雑成分除去について調べるため、LC-MS/MS 法で定量測定を行ったところ、回収率が 59.9-63.7％であったが、試験液を 10 倍、100 倍と希釈するにつれ、回収率がそれぞれ、81.7-84.2％、97.5-98.5％に向上した。本章で検討した方法では、夾雑成分が十分に除去されないことが分かった。また、微生物試験の工程の一つにある抽出液の中和操作が極めて煩雑であるため、AP の特性と抽出液の液性から、中和操作を省略した試料調製方法を第 3 章で検討した。 3 章では、牛試料を用いて AP を LC-MS/MS で定量測定する為の試料調製方法を検討した。牛試料に残留基準値（MRL）の AP（牛筋肉、牛試料：0.5 ppm、牛肝臓：5 ppm）を添加し、試料調製方法の検討を行った。抽出方法は、アルカリ加水分解抽出と n-ヘキサン（ヘキサン）存在下でトリクロロ酢酸抽出（ヘキサン-TCA 抽出）の二種類を検討した。LC-MS/MS測定用試料の調製は AP が水溶性の性質があることから、親水性-親油性バランス型（HLB）固相に抽出液を通液することと、AP は pKa（8.5）であることと、抽出液の液性が強酸性であることから、抽出液から AP を回収する固相として、逆相系強陽イオン交換固相を用いた。本論文では、2 種類の HLB 固相を選定し、1 種類の固相で精製した場合と、2 種類の 2 個の固相を連結した場合で不純物の除去効果を検証した。また、AP を回収する固相は 2 種類（MCX、MC1）を選定し、HLB 固相との組み合わせで抽出液の精製を評価した。評価は選択性と回収率とし、評価基準は厚生労働省による、食品中に残留する農薬等に関する試験法の妥当性評価ガイドライン（ガイドライン）に基づいた。結果は、いずれの試料調製方法でもガイドラインの基準に適合したが、選択性の結果などから 2 種類の HLB固相と MCX の 3 つの固相を組み合わせた精製方法が最も良好な結果が得られることが分かった。また、AP は高極性で有機溶媒に難溶という特性のため、脂肪と共に抽出することが困難で、脂肪中の AP 測定方法が確立されていなかったが、アルカリ加水分解では脂肪を可溶化して抽出、ヘキサン-TCA 抽出では、他の部位よりヘキサンの割合を増やし抽出を行った。これにより牛脂肪の分析にも適応可能であると初めて実証した。 第 4 章では、畜産物中の AP 定量方法の妥当性評価を行った。本章では、MRL（牛筋肉、牛試料：0.5 ppm、牛肝臓：5 ppm）と MRL の 1/10（1/10 MRL; 牛筋肉、牛試料：0.05 ppm、牛肝臓：0.5 ppm）になるようにアプラマイシンの標準液を添加した牛肉試料を用いて、第3 章のヘキサン-TCA 抽出法の妥当性評価を行った。妥当性は厚生労働省のガイドラインに基づき、選択性、真度、精度、定量限界値について評価した。選択性は、牛のブランク試料を前処理し、LC-MS/MS 測定した結果、AP の保持時間付近に検出される妨害ピークの面積値を、マトリックス中の標準溶液 MRL の面積値で除して 1/10 未満（0.1 未満）を許容範囲とした。選択性の結果は牛の筋肉、脂肪、肝臓で、0.010-0.034 となり、すべての組織でガイドラインの許容範囲内となった。真度、併行精度は、標準添加した牛の各組織を５回測定した結果より算出した。結果は、真度が MRL で 84.3-92.7%、1/10 MRL で 79.2-97.8%となり、ガイドラインの目標値（70-120％）を満足した。併行精度は MRL で 2.1-5.9%、1/10MRL で 2.8-5.7％となり、ガイドラインの目標値（15％未満）を満足した。定量限界値の評価は、S/N 比が 10 以上を条件となる。牛の筋肉、脂肪、肝臓の 1/10 MRL における S/N 比は、676.3- 7190.3 となり、ガイドラインの目標値（10 以上）を満足した。S/N 比及び真度、併行精度の結果から、開発した試験方法が、牛の筋肉と脂肪で 0.05 ppm、牛の肝臓で 0.5 ppmを LOQ として適応可能であることが分かった。これにより、LC-MS/MS 法を用いた絶対検量線法による畜産物中の AP の定量方法を確立し、今までに開発されてきた方法より簡便で高感度な定量方法が実現できた。しかしながら、豚の様により小さい MRL（豚の筋肉、脂肪、肝臓で 0.06 ppm）の試料を測定する場合や、一律基準値（0.01 ppm）に適応するためには、より夾雑成分を除去する方法を検討する必要がある。 第 5 章では、本論文の成果の要約と、今後の課題、将来性及び地域への貢献の可能性について述べた。; The major goal of this thesis to develop a method for the determination of apramycin in livestock products by liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). An extraction study was conducted in first study to establish a method for preparing sample from livestock products for quantitative apramycin measurement by LC–MS/MS. Apramycin was extracted from samples via alkaline hydrolysis or with trichloroacetic acid (TCA) in the presence of n-hexane (hexane). Next, matrix components were removed from the extracted apramycin using two types of hydrophilic-lipophilic balanced (HLB) solid-phase extraction (SPE) cartridges, and apramycin was retained with strong cation-exchange SPE cartridges. Apramycin recovery from the extract was evaluated using bovine muscle, liver, and fat samples with apramycin at the maximum residue limit-value (muscle and fat: 0.5 ppm, liver: 5 ppm). The recovery rate of alkaline hydrolysis extraction was 75.5-90.1% and hexane-TCA extraction was 77.3-92.6%, demonstrating that this method could sufficiently remove matrix components that would affect the measurement, as indicated by guidelines of the Ministry of Health, Labour and Welfare. The method examined in this study is effective for apramycin residue sample preparation in livestock products for quantitative LC-MS/MS measurements.A validation study was conducted in next study to establish a method for determining apramycin by LC-MS/MS in bovine muscle, fat, and liver. Bovine tissue samples (e.g., muscle, fat, and liver) were extracted using the n-hexane–trichloroacetic acid (hexane–TCA) method, and cleanup was performed using two differenthydrophilic–lipophilic balance (HLB) cartridge columns and a MCX cartridge column for these samples. The apramycin in the resulting samples was quantified by LC-MS/MS by utilizing an external calibration curve. The validation study was performed on bovine tissues spiked with apramycin at maximum residue limits (MRLs; muscle and fat: 0.5 ppm; liver: 5 ppm) and a value equivalent to 1/10 of MRLs (1/10 MRLs; muscle and fat: 0.05 ppm, liver: 0.5 ppm). The trueness (n ＝ 5) values of apramycin based on the used three kinds of bovine tissue were 84.3%–92.7% at MRLs and 79.2%–97.8% at 1/10 MRLs, and the relative standard deviations (RSD) were 2.1%–5.9% at MRL and 2.8%–5.7% at 1/10 MRLs. The quantitation limits of the developed method were 0.05 mg/kg (0.05 ppm) for bovine muscle and fat and 0.5 mg/kg (0.5 ppm) for the bovine liver according to the results of the validation study.These results suggest that the established method for the quantitation of apramycin by an external calibration method using LC-MS/MS well fits bovine tissues.In the future, we plan to examine the applicability of the uniform limit (0.01 ppm) for suitability with pig liver (MRL: 0.06) and examine whether the extraction method can be applied to other aminoglycoside antibiotics while assuming its application to the screening measurements of aminoglycoside antibiotics.; 本文/三重大学大学院地域イノベーション学研究科; 79p
• Persistent ID (NDL): info:ndljp/pid/13024107; https://dl.ndl.go.jp/pid/13024107
• Collection: 障害者向け資料
• Collection (Materials For Handicapped People:1): テキストデータ
• Collection (particular): 国立国会図書館デジタルコレクション > デジタル化資料 > 博士論文; https://dl.ndl.go.jp/collections/A00014
• Acquisition Basis: 博士論文（自動収集）
• Date Accepted (W3CDTF): 2023-10-11T15:41:05+09:00
• Format (IMT): application/pdf
• Access Restrictions: 国立国会図書館内限定公開
• Service for the Digitized Contents Transmission Service: 図書館・個人送信対象外
• Availability of remote photoduplication service: 可
• Periodical Title (URI): http://hdl.handle.net/10076/0002000079; https://mie-u.repo.nii.ac.jp/records/2000079
• Data Provider (Database): 国立国会図書館 : 国立国会図書館デジタルコレクション; https://dl.ndl.go.jp