生殖工学技術を利用した子ウシの性別制御に関する研究

• Material Type: 博士論文
• Title: 生殖工学技術を利用した子ウシの性別制御に関する研究
• Author/Editor: 秋山, 清
• Author Heading: 秋山, 清
• Publication Date: 2016-01-25
• Publication Date (W3CDTF): 2016-01-25
• Alternative Title: Studies on Producing Calves of Desired Sex Using Reproduction Engineering Technologies
• Degree grantor/type: 麻布大学
• Date Granted: 2016-01-25
• Date Granted (W3CDTF): 2016-01-25
• Dissertation Number: 乙第5号
• Degree Type: 博士(学術)
• Conferring No. (Dissertation): 乙第5号
• Text Language Code: jpn
• Target Audience: 一般
• Note (General): 性判別胚を用いて計画的な子ウシ生産を農家段階で実用化するためには、性判別胚を超低温保存し、受胚牛の移植適期に合わせて融解し移植できる技術体系の確立が不可欠である。しかし、性判別胚はバイオプシーにより胚の一部の細胞が切除されるとともに透明帯も除去されるため、緩慢凍結により保存された性判別胚において新鮮胚と同等の受胎性を確認した報告がある一方で、インタクト（非バイオプシー）胚と比べて耐凍性や受胎性が低下することも報告されている。しかし、性判別胚をガラス化保存した場合には新鮮胚に近い受胎率の得られることが報告されている。 ガラス化保存法は、細胞外液に氷晶を形成させないため、緩慢凍結法に比べて高濃度の耐凍剤を含む溶液が用いられており、加温後は早期に耐凍剤を希釈することが、耐凍剤の化学的毒性を抑制するために必要とされている。このためガラス化保存胚をダイレクトトランスファー法やワンステップストロー法のように加温後直ちに受胚牛に移植した報告は少ない。 一方、X精子またはY精子を90%以上の確率で含むウシ性選別精液が市販されているが、この性選別精液はストロー1本あたりの充填精子数が通常精液に比べて少ないことなどから、人工授精後の受胎率や多排卵処理後に採取した胚の移植可能な胚の生産率の改善が望まれている。また、ウシにおける生体内卵吸引法（以下、OPU）由来卵子の体外受精技術は、超音波画像診断装置を用いて生体卵巣から採取した卵を体外受精して胚を生産する技術であり、これまでの胚生産の中心であった子宮灌流による体内受精由来胚の採取に代わる、あるいはこれを補完する胚生産技術として開発されてきた。この体内成熟卵は、体外受精後の発生能が体外成熟卵に比べて高いが、体内成熟卵と性選別精液を利用した性判別胚の生産に関する報告や生産した性判別胚の受胎性に関する報告は少なく、普及性や実用性に関する報告はほとんどない。 本論文では、ウイバイオプシー胚および性判別胚の超低温保存後の生存性と受胎性を明らかにし、農場における子ウシの雌雄産み分け技術の確立を目的として、ウシ胚の緩慢凍結およびガラス化保存の方法や融解・加温法の影響について調べた。また、OPUにより採取した体内成熟卵と性選別精液の体外受精による性判別胚の生産について、胚の生産効率と性判別胚を用いた子ウシ生産システムを検討した。 第2章では、ウシバイオプシー胚の緩慢凍結方法が胚の生存性と受胎性に及ぼす影響を調べた。過剰排卵処理を施した供胚牛から人工授精後7～8日目に採取した胚はマイクロブレードでバイオプシーした後に緩慢凍結保存した。緩慢凍結方法は10%グリセリンおよび20%子ウシ血清（以下、CS）添加修正PBSを凍結溶液として融解後に段階的に耐凍剤を希釈除去し胚の生存性を判定した後に受胚牛に移植した10G-SW、融解後にストロー内で12.5%シュークロースおよび20%CS添加修正PBSと混合して一段階で耐凍剤を希釈除去し胚の生存性を判定した後に受胚牛に移植した10G-ISD、10%エチレングリコールおよび20%CS添加修正PBSを凍結溶液として融解後に耐凍剤の除去操作を行わず直ちに受胚牛に移植した10E-DR、10%エチレングリコール0.1mol/Lシュークロースおよび20%CS添加修正PBSを凍結溶液として融解後に耐凍剤の除去操作を行わず直ちに受胚牛に移植した10E1S-DR、10%グリセリン0.25 mol/Lシュークロースおよび20%CS添加修正PBSを凍結溶液として融解後に耐凍剤の除去操作を行わず直ちに受胚牛に移植した10G25S-DR、5%グリセリン0.1 mol/Lシュークロースおよび20%CS添加修正PBSを凍結溶液として融解後に耐凍剤の除去操作を行わず直ちに受胚牛に移植した5G1S-DRの6手法を用いてインタクト胚とバイオプシー胚の保存後の生存性と受胎性を調べた。その結果、インタクト胚の受胎率は凍結法との間には有意差は認められなかったが、バイオプシー胚の受胎率は10E1S-DRが新鮮胚、10G-SWおよび10G25Sに比べて有意に受胎率が低かった。また、いずれの方法においてもバイオプシー胚の受胎率はインタクト胚に比べて低い成績となっており、バイオプシー胚に適した緩慢凍結法について更なる検討が必要と推察された。また、緩慢凍結したインタクト胚を移植により双子分娩が確認された事例から、ウシにおける自然発生的な一卵性双子の発生様式を記載して考察した。 第3章では、ガラス化保存したウシ胚をストロー内希釈後に直接移植する方法を農家段階で実用化するために、加温温度、加温後の経過時間、希釈液の組成が加温後の胚の生存性に及ぼす影響を検討した。媒精後7～8日目に発生した胚盤胞をガラス化溶液(VSED: 25% EG + 25% DMSO)で平衡した後にストロー内でガラス化保存し、加温後に胚の生存性と発育性を調べた。加温温度は20℃区と30℃区において加温後の胚の生存率および透明帯脱出率に有意な差は認められなかった。また、加温後の保持時間0分に対して5分以降は、ガラス化保存胚の生存率が有意に低下し、0分および5分に対して40分でガラス化保存胚の透明帯脱出率が有意に低下した。さらに、希釈液組成により加温後の胚の生存率および透明帯脱出率に差は認められなかった。これらのことから、ガラス化保存したウシ胚において、加温温度の違いや希釈液の組成により生存性の低下は認められなかったが、加温から移植終了までの時間が延長した場合、加温胚の生存性が低下することが示された。 第4章では、ガラス化保存したウシバイオプシー胚を、農場内で加温し直ちに受胚牛に移植するために、耐凍剤の希釈方法が受胎性に及ぼす影響を調べた。人工授精後7日目の供胚牛から採取し、性別判定のためにバイオプシーを施した胚をVSED液で平衡した後、ストロー内でガラス化保存した。加温後、耐凍剤をストロー内で希釈しストローから取り出し胚の生存性を確認して移植したISD区の受胎率は57.9%、耐凍剤をストロー内で希釈後に胚をストローから取り出すことなく直ちに受胚牛に移植したDIR区の受胎率は62.5%であり、いずれもガラス化保存していないNV区（56.3%）と有意な差のない受胎率が得られた。ストロー内希釈後のストロー内のエチレングリコール濃度は6.9～7.7%、DMSO濃度は2.8～3.3%であった。これらのことから、ガラス化保存したウシバイオプシー胚は、農場内での加温操作を行い直ちに受胚牛に移植することが可能であり、実用的な受胎率の得られることが示唆された。 第5章では、ガラス化保存したウシ性判別胚を加温後直ちに受胚牛に移植するために、耐凍剤のストロー内希釈が移植後の受胎性と子ウシ生産性に及ぼす影響を調べた。過剰排卵処理を施した供胚牛から人工授精後7～8日目に採取した胚をマイクロブレードでバイオプシーして雄特異的DNA増幅の有無により性別を判定した。性判別胚はVSED液で平衡し、希釈液と空気層を隔てて0.25-mLストロー内に充填し、液体窒素中に投入した。加温後、ストロー内でガラス化液と希釈液を混合し3分間保持した。評価区はストロー内希釈した胚の生存性を判定した後に受胚牛に移植し、非評価区ではストロー内希釈後の胚をストローから取り出すことなく直ちに受胚牛に移植した。評価区および非評価区の移植後の受胎率は38.7%および34.8%であり、両区の間に有意差は認められなかった。しかし、評価区においてガラス化保存前の品質の劣る胚の生存性は品質の高い胚に比べて有意ではないが低い傾向であった（P = 0.087）。受胎した受胚牛の流産率は両区の間で有意な差は認められなかった（13.9%、12.5%）。これらのことから、耐凍剤のストロー内希釈はガラス化保存したウシ性判別胚を加温後直ちに受胚牛に移植するために有効な方法であることが確認された。 第6章では、ホルスタイン種泌乳牛の卵巣よりOPUにより採取した卵と性選別精液を用いて体外受精し、性判別胚の生産効率と性判別胚の移植による子ウシ生産状況を調べた。供試牛に多排卵処理（SOV区）または卵胞発育同調処理（FGT区）を施した後、直径5 mm以上の卵胞から卵を採取し、ホルスタイン種雄牛の性選別精液を用いて媒精し、胚盤胞期胚以降への発生能を調べた。また、媒精後7および8日目の胚盤胞期胚および脱出中胚盤胞期胚を受胚牛に移植した。SOV区およびFGT区における採取卵数に有意な差は認められなかった。SOV区では採取卵のうち62.1%が成熟卵であったが、FGT区の採取卵は全て未成熟卵であった。媒精後7～9日の胚盤胞期胚率は試験区間に有意な差は認められなかったが、供卵牛１頭当たりの胚盤胞期胚数はSOV区がFGT区に比べて有意に多かった（P < 0.05）。また、SOV区およびFGT区で生産した性判別胚の移植後の受胎率、在胎日数および産子の生時体重に有意な差は認められなかった。このことから、ホルスタイン種泌乳牛からSOV処理後にOPUにより採取した卵と性選別精液を体外受精して性判別胚を生産する方法は、後継牛の計画的な生産に利用可能であることが示された。 本研究の結果より、ウシバイオプシー胚および性判別胚の超低温保存としては緩慢凍結法に比べてガラス化保存法が優れており、ウシ性判別ガラス化保存胚は、新鮮胚移植と同等の実用的な受胎率が得られることが明らかとなった。また、ガラス化保存胚のストロー内希釈は超低温保存した性判別胚を農場で加温し、一般的な胚移植と同様の簡単な操作により受胚牛への移植が可能なことを示した。さらに、ストロー内希釈後の胚の生存性および受胎性に影響を及ぼす要因となる胚の品質や加温後から移植までの時間を確認したことにより、本技術の野外普及を進めるにあたっての注意点や技術普及のための課題を提示した。また、SOV処理後にOPUにより採取した体内成熟卵と性選別精液との体外受精による新しい性判別胚の生産システムが後継牛生産に有効な手法であることを示した。 このように本研究で実施したウシバイオプシー胚および性判別胚の超低温保存方法およびOPU由来の成熟卵と性選別精液を利用した性判別胚の体外生産に関する研究成果は、酪農経営ならびに肉牛生産における計画的な後継牛生産の実現と今後の家畜繁殖技術の発展に寄与するものと考えられる。; Although sexing of bovine embryos has been applied to cattle industries, especially as commercial embryo transfer technologies, cryopreservation of sexed bovine embryos resulted in reducing the viability and the pregnancy rate after the embryo transfer. The objective of the present study was to improve cryopreservation of sexed bovine embryos and superovulation protocol for in vitro production (IVP) of bovine embryos using X-sorted sperm.Viability of biopsied bovine embryosThe objective of this study was to improve the viability of biopsied/cryopreserved embryos in the cattle. Bovine embryos collected from donor females on day 7 (d7: day 0 = onset of estrus), and were then biopsied for sexing by PCR or LAMP. The freezing solutions 1) 10% glycerol (G) (10G-SW, 10G-ISD) in PBS supplemented 20% calf serum (mPBS: mdodified PBS), 2) 10% ethylene glycol (EG) (10EG-DR) in mPBS, 3) 10% EG and 0.1 mol/L sucrose in mPBS (10E1S-DR), 4) 10% G and 0.25 mol/L sucrose (S) in TCM199 supplemented 20% CS (10G25S-DR) and 5) 5% G and 0.1 mol/L S in TCM199 supplemented 20% CS (5G1S-DR) were compared. In the 10G-SW and the 10G-ISD treatments, embryos were expelled from the plastic straws, and that the survival of frozen-thawed embryos was observed before transfer. In the 10E-DR, the 10E1S-DR, the 10G25S-DR and the 5G1S-DR treatments, embryos were transferred directly to recipients without expelling embryos from the straws, the development and pregnancy rates were assessed. There were no significant differences among the pregnancy rates between the groups in intact embryos (P > 0.05). However, the pregnancy rate of the 10E1S-DR was significant lower than them of the fresh (non-frozen) embryos, the 10G-SW and the 10G25S-DR in biopsied embryos (P < 0.05). Transfer of the blastocyst that divided into two half-blastocysts in a zona pellucidaThree expanded blastocysts were collected from the Japanese Black cow on the d7 after insemination, and cryopreserved in liquid nitrogen (LN). One of the frozen-thawed blastocysts contained two half-blastocysts in the zona pellucida. The embryo was then transferred to the recipient cow, and twin calves, that were females and their birth weight, 13.0 kg and 14.0 kg each, were born on the 261 day after transfer. The results demonstrate that a successful birth of identical twin calves after transfer of a blastocyst had two half-blastocyst in a zona pellucida. Effects of warming procedure on the viability of vitrified bovine embryosThe objective of this study was to examine factors affecting the post-warming viability of bovine embryos. In vitro produced blastocysts of d7-8 age were vitrified with 25% EG (v/v), 25% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO) and 0.3% (w/v) bovine serum albumin (BSA) dissolved in PBS by using 0.25-mL straws as devices. The vitrified-warmed embryos were morphologically evaluated to examine embryonic survival after warming and by a in-straw dilution method. There were no effect of warming temperature and dilution solution on the survival and hatching rates of vitrified-warmed embryos. However, the survival of vitrified embryos held at 38.5℃ after warming significantly degreased when the holding for more than 5 min compared with the holding for 5 min (P < 0.05). The hatching rate of embryos the holding for 40 min after warming was significant lower than those of the no-holding and holding for 5 min (P < 0.05). Maintaining embryos in the dilution medium for longer periods would be detrimental after warming, thus that causes lowering the pregnancy rate after transfer of vitrified/warmed embryos.Viability of biopsied-vitrified bovine embryos after in-straw dilutionThe objective of this study was to evaluate the viability of biopsied-vitrified bovine embryos. Bovine embryos staged from the compacted morula to the blastocyst stage on d7 (day 7: day 0 = onset of estrus) were collected from donor females, biopsied for sexing, and vitrified with 25% EG (v/v), 25% DMSO (v/v) and 0.3% BSA (w/v) dissolved in PBS using 0.25-mL straws. We assessed the concentrations of cryoprotectants in the straw after in-straw dilution, and the percentages (v/v) were 6.9-7.7% for EG and 2.8-3.3% for DMSO. The pregnancy rate of vitrified-warmed embryos in the in-straw dilution group (ISD group) was 57.9% when embryos were expelled from the straws after diluting the cryoprotectants in the straws, and that the survival of vitrified-warmed embryos were observed before transfer. In contrast, the pregnancy rate in the directly transfer group (DIR group) was 62.5% when embryos were transferred directly to recipients without expelling embryos from the straws. There were no differences among the pregnancy rates of the ISD group (P > 0.05), the DIR group and the non-vitrified biopsied embryos (NV group) (56.3%). The results suggest that it was possible to warm the vitrified-biopsied bovine embryos on farms and to transfer them immediately to recipients, yielding a practical pregnancy rate.Calf production from sexed-vitrified bovine embryos following in-straw dilutionThe objective of this study was to develop an in-straw dilution method, which is suitable for direct transfer of sexed-vitrified bovine embryos. Embryo sexing was performed by molecular diagnosis via PCR or LAMP. Several of the sexed and vitrified-warmed embryos were transferred after evaluation of survival of the embryos at warming and in-straw dilution (Evaluation group). The other embryos were immediately directly transferred to recipients without first being expelled from the straws after in-straw dilution (Non-evaluation group). The pregnancy rates of sexed- vitrified embryos were 38.7% and 34.8% in the Evaluation group and Non-evaluation group, respectively, which were not significantly different (P > 0.05). The viability of lower-quality embryos before vitrification tended to be lower (P = 0.087) than that of the higher-quality embryos, regardless of evaluating embryos after warming and in-straw dilution. The abortion rates of the embryos were similar, and there was no difference (P > 0.05) between the two groups (13.9% and 12.5%, respectively). The results demonstrate that sexed-vitrified bovine embryos can be vitrified and diluted by the in-straw method, and that the vitrified and warmed sexed-embryos can develop to term.In vitro production of bovine sex preselected embryo using X-sorted spermThe objective of this study was to examine that superstimulation protocol for in vitro production (IVP) of bovine embryos using X-sorted sperm. The superstimulations were conducted to lactating Holstein cows using SOV group and FGT group in a cross-over design. In the SOV group, all cows received a controlled intravaginal progesterone device on a random day of estrus cycle (0 d). Dominant follicle ablation was underwent on 5 d, superovulation was induced by intramuscular administration of eight declining doses of FSH and PGF2α beginning on evening of 6 d, following standard procedure. Controlled intravaginal progesterone device was removed on morning of 9 d. For LH surge induction, GnRH was administered on the morning of 10 d. Therefore, ovum pick up (OPU) was carried out on the morning of 11 d (25 to 26 h after GnRH injection). In the FGT group, OPU was carried out on a random day of estrus cycle (0 d). Dominant follicle ablation and insertion of a controlled intravaginal progesterone device was underwent on 5 d, superstimulation was induced by intramuscular administration of eight declining doses of FSH and PGF2α beginning on morning of 7 d, following standard procedure. Therefore, ovum pick up (OPU) was carried out on the morning of 11 d. Oocyte quality was assessed by developmental ability after in vitro/in vivo maturation and subsequent in vitro fertilization using X-sorted sperm and culture. There were no difference between groups in the number of oocytes that were recovered from > 5 mm follicles. All recovered oocytes were immature in FGT group, although the matured oocyte accounted for 62.1% among the recovered oocytes in SOV group. There were no differences among blastocyst rates of the SOV group (34.0 ± 4.3%) and the FGT group (21.8 ± 7.3%). However, the number of blastocysts per OPU session was higher in the SOV group compared with the FGT group (6.3 ± 1.4 and 2.2 ± 0.2, P < 0.05). IVP embryos derived from the SOV group and the FGT group that had been cryopreserved and fresh embryos were transferred to recipient animals, no significant differences were observed in the rate of pregnancy (37.5% and 35.7%), gestation length (276.2 ± 1.7 and 278.9 ± 1.4 d), birth weight (41.8 ± 3.1 and 45.3 ± 1.7 kg) of offsprings. These results indicate that many transferable blastocysts can be produced by IVF with X-sorted sperm using in vivo matured oocytes derived by OPU from lactating Holstein cows.In conclusions, the results of the present study demonstrate that sexed embryos that were vitrified and diluted by the in-straw method can be applied to the field work in cattle industries with the same efficiency as a fresh sexed-embryos. The present study demonstrates that it is very useful and available for dairy production of successors to apply the new system for in vitro production of bovine embryos using in vivo-derived oocytes via OPU and sorted sperm for sexing as gametes for IVF. The findings in the present studies would increase productivity and contribute to development in cattle industries.
• Persistent ID (NDL): info:ndljp/pid/9902050; https://dl.ndl.go.jp/pid/9902050
• Collection: 障害者向け資料
• Collection (Materials For Handicapped People:1): テキストデータ
• Collection (particular): 国立国会図書館デジタルコレクション > デジタル化資料 > 博士論文; https://dl.ndl.go.jp/collections/A00014
• Acquisition Basis: 博士論文（自動収集）
• Date Accepted (W3CDTF): 2016-03-01T12:53:35+09:00
• Date Created (W3CDTF): 2016-02-09
• Format (IMT): PDF; application/pdf
• Access Restrictions: 国立国会図書館内限定公開
• Service for the Digitized Contents Transmission Service: 図書館・個人送信対象外
• Availability of remote photoduplication service: 可
• Periodical Title (URI): http://id.nii.ac.jp/1112/00004487/
• Data Provider (Database): 国立国会図書館 : 国立国会図書館デジタルコレクション; https://dl.ndl.go.jp

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2023-03-01 再収集

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