虚血/再灌流障害におけるHBOのapoptosis抑制と細胞増殖効果の検討

• Material Type: 博士論文
• Title: 虚血/再灌流障害におけるHBOのapoptosis抑制と細胞増殖効果の検討
• Author/Editor: 右田, 平八
• Author Heading: 右田, 平八
• Publication Date: 2016-03-19
• Publication Date (W3CDTF): 2016-03-19
• Alternative Title: Hyperbaric oxygen therapy to suppresses apoptosis and promote renal tubular regeneration after renal ischemia/reperfusion injury in rats.
• Degree grantor/type: 九州保健福祉大学
• Date Granted: 2016-03-19
• Date Granted (W3CDTF): 2016-03-19
• Dissertation Number: 甲第ツ052号
• Degree Type: 博士(保健科学)
• Conferring No. (Dissertation): 甲第ツ052号
• Text Language Code: jpn
• Subject Heading: 高気圧酸素治療; 虚血/再灌流障害; 抗Ki-67抗体; アポトーシス; TUNEL法; hyperbaric oxygen therapy; ischemia-reperfusion injury; Ki-67; apoptosis; TdT-mediated dUTP nick end labeling
• Target Audience: 一般
• Note (General): 【目的】急性腎障害 (AKI) は急激な腎機能の低下の結果、体液の恒常性が維持できなくなった状態である。AKI の生命予後は悪く、特に尿細管壊死によるものでは、原因を除去しても直ちには腎機能が回復せず有効な手段はないと報告されている。AKI が持続する場合には、腎機能の低下から深刻な病態へと進行することが知られている。有川らは、AKI を含む多臓器不全に対してHBO が有効であることを報告しているが、AKI 治療ガイドラインによる腎臓の治療にHBO は推奨されていない。このような背景から、本研究では、HBO の適応疾患としてAKI に着目した。HBO は、虚血/再灌流 (I/R) 障害における尿細管損傷、および炎症の重症度を軽減することが先行研究で示されている。しかし、HBO による細胞死の抑制と細胞増殖の亢進については検証されていない。今回、腎I/R 障害に対するHBO の影響を確認するため、組織の形態観察に加えて、TUNEL と抗Ki-67 抗体を用いてそれぞれapoptosis と細胞増殖について検討した。【対象および方法】１．実験動物と対照群SD ラットを無作為にSham 群、I/R 群、I/R +HBO 群の3 群 (各群n = 10) に選んで行った。動物飼育室では急激な温度と湿度変化が起きないように温度 (24 ～ 26℃) と湿度 (40 ～ 70%) を空調管理し、餌と水は自由に摂取した。I/R の24 時間、48 時間後に安楽死させて標本を作製した。当該の動物実験は、動物の愛護及び管理に関する法律 (法律第105 号1973 年) を遵守し、九州保健福祉大学内の動物実験委員会の承認 (受付番号25105) を得て行った。特記する利益相反 (COI) はない。２．外科的手順ラットの麻酔は、ペントバルビタール (pentobarbitone: 50 mg/kg) を注射器で腹腔内に投与し、術野の剃毛、皮膚をエタノール消毒後に直腸温度が 34 ～ 36ºC に維持するように加温テーブル上に置いて体温調節した。痛覚が無いことを確認して、腹部正中切開を実施した。右腎摘出には、尿管と腎動静脈をそれぞれ糸で2ヶ所結索し、結索した中間をハサミで切断し、副腎や脂肪等を剥離して腎臓を摘出した。次に左腎動静脈を非外傷性クリップ (Fine Science Tools Inc., Foster City, CA) で30 分間クランプすることにより虚血を誘導した。クランプを解除した後、1 分以内の再灌流を視覚的に確認して切開部を縫合した。Sham ラットは同様に開腹して腎臓を露出したが、右腎摘出と左腎虚血を行わずに腹部を縫合した。３．HBO 処置I/R +HBO 群は動物実験用HBO 装置 (Barotec Hanyuda P-5100 Tokyo. Japan) を使用して2.5 気圧下 (酸素濃度100%) で60 分間のHBO 処置を施行した。４．HE 染色病理組織の一般的染色法であるHE 染色を用いて、細胞および組織構造を光学顕微鏡で全体像の把握を行い、組織の形態観察を目的に行った。５．apoptosis 標識apoptosis の標識には、TUNEL を用いた。染色は、ラベリング反応、次いで抗体反応、発色反応の各工程で行い、封入後に光学顕微鏡で観察し、四塩酸塩(3,3’-Diaminobenzidine, Tetrahydrochloride: DAB) による反応で核内に黒褐色に発色を認めるものを陽性とした。６．抗Ki-67 抗体二重染色Ki-67 は細胞周期関連核タンパク質で、増殖中の細胞で発現する。増殖を休止しているG 0 期においては存在しないので、細胞増殖のマーカとして用いられている。染色は、抗Ki-67 抗体で1 次反応させ、Alexa 488 Rabbit で2 次反応させた後に核染色 (DAPI)を行った。陽性細胞は抗Ki-67 抗体とDAPI を組合せ、蛍光観察で発光した陽性細胞のみをカウントした。７．組織形態観察標本を、デジタルカメラを備えた光学顕微鏡を用い、接眼レンズ (10x) に対物レンズ(10x、20x、40x) を組合せて各群の皮質、髄質を観察した。観察記録として、それぞれの皮質、髄質をデジタルカメラで撮影し、撮影条件を露出時間 1.2 秒、ISO 感度400 とし、JPEG ファイル方式で保存した。TUNEL とKi-67 陽性細胞数は1 標本中の計測を10 視野で行い、全標本の1 視野 (240 mm × 180 mm) 毎の平均値を求めた。８．統計分析数値は平均値 ± 標準偏差 (mean ± SD) で表示し、グラフは平均値 ± 標準誤差(mean ± SE) で示した。統計学的解析には、統計ソフトウェアStat Mate Ⅳ (ATMS Co.,Ltd., Tokyo, Japan) を使用した。TUNEL 陽性細胞数とKi-67 陽性細胞数の計測は、Sham群、I/R 群、I/R +HBO 群で行った。3 群間の比較には、Tukey 法を用いた。有意水準 p < 0.05 を統計学的有意差ありとした。【結果】１．HE 染色I/R 24 時間後の皮質の観察では、エオジンに濃染し、微絨毛を有する大型細胞からなる近位尿細管と細胞境界明瞭な遠位尿細管を観察した。I/R とI/R +HBO の皮質の尿細管と腎小体の形態変化は明瞭には観察されなかった。髄質では、I/R の尿細管の膨化、近位尿細管の刷子縁・基底陥入の消失が観察された。また、脱落細胞による壊死様の核変化、尿細管腔の拡張、尿管腔の崩れが観察された。I/R +HBO の髄質は尿細管組織が比較的良好に保たれていた。２．TUNEL 陽性細胞TUNEL は、Sham の皮質と髄質で発現が観察されなかった。I/R の皮質では、尿細管上皮細胞で多く観察された。また、髄質でも尿細管上皮細胞にTUNEL 陽性細胞を多く観察した。I/R +HBO では、皮質と髄質に発現を観察したが、I/R に比べて発現が少なかった。I/R +HBO は、皮質と髄質でI/R と比較して発現数の減少が認められた。皮質および髄質において、I/R +HBO 群はI/R 群と比較し、apoptosis を有意に抑制した。３．Ki-67 陽性細胞Sham の抗Ki-67 抗体の発現は、皮質と髄質の尿細管上皮で少数が散在的に観察された。I/R は皮質と髄質で発現が観察された。I/R +HBO は発現した細胞がI/R に比べて多く観察された。I/R +HBO は、皮質と髄質でI/R と比較して発現数の増加が認められた。皮質での有意差は、Sham とI/R に有意差があった。また、Sham とI/R +HBO で有意差があった。I/R とI/R +HBO に有意差があった。髄質での有意差は、Sham とI/R で有意差があった。また、Sham とI/R +HBO で有意差があった。I/R とI/R +HBO に有意差があった。【考察】HBO を腎I/R 後に行うことで、apoptosis は有意に抑制された。腎組織の形態観察では、I/R 群は壊れた組織が頻繁に観察され、I/R +HBO 群ではI/R に比べて崩れた組織が少なく観察された。一因として、低酸素組織への酸素供給は、組織周囲の血液循環に依存しており、HBO によって上昇した酸素拡散能と増加した溶解型酸素によって低酸素組織に酸素供給が効率よく供給されたと考えられる。apoptosis については、apoptosis 陽性細胞をTUNEL で評価したところ、I/R と比べてI/R+HBO で有意に抑制されていた。HBO で処置したラットはI/R に比べてTUNEL が少ないことから、apoptosis の抑制に関与していることが推察された。また、apoptosis について、Sharples らは、造血因子であるerythropoietin (EPO) の産生でI/R 障害後のapoptosis を減少したというEPO の抗apoptosis 効果を報告した。その機序として、I/R 障害に起因するcaspase-3、caspase-8、およびcaspase-9 の活性を抑制することを証明している。これらを今回の実験と照合すると、HBO が造血因子に係わることからapoptosis 抑制に関連していることが推測される。しかし、現段階では、HBO がapoptosis 開始段階のcaspase-8 と実行段階のcaspase-3 を活性抑制することは確認されていない。抗Ki-67 抗体については、I/R の抗Ki-67 抗体の発現は少なく、I/R +HBO では、I/R に比べて多く発現した。I/R には尿細管の崩れが多いことから、早期に細胞周期に進行すると予測したが発現は少なかった。これは、I/R により損傷を受けた核の細胞周期が長くなり、修復前に細胞死に至ることが推測された。I/R の尿細管細胞増殖のダイナミックな評価には、抗Ki-67抗体が有効である。しかし、染色強度をどのレベルで陽性とするかによって陽性率が大きく変わることが懸念される。I/R 障害に選択した腎臓は他臓器と比べると解剖学的、機能的に複雑であり、未解明な部分が多い。しかし、HBO は細胞障害とその回復過程において重要な役割を果たす蓋然性があり、細胞組織に正常な尿細管、または残存した上皮細胞を量的、機能的に残すことが腎障害の進行を抑制する上で重要である。【結論】腎I/R 障害に対して行うHBO は、I/R 障害後のapoptosis を抑制し、尿細管上皮細胞の再生を亢進させる可能性がある。; Background: Renal ischemia/reperfusion (I/R) injury remains a major cause of .acute kidney injury (AKI). In addition, I/R injury induced tissue inflammation, necrosis and apoptosis.Apoptotic cell death has been documented in animal models and human biopsies after renal I/R, and inhibition of apoptotic signaling and cell death ameliorates the associated injury and inflammation in a murine model.Wen et al demonstrated in the study using the monoclonal antibody, Ki-67 that tubular cell regeneration and proliferation were important element of renal recovery in AKI.Hyperbaric oxygen therapy (HBO) is defined as a treatment in which a patient intermittently exposed to 100% oxygen while the treatment chamber is pressurized to a tow ATA. HBO has been used in medical conditions with a proven efficacy in a limited number of disorder. However, the effects of HBO on apoptosis and proliferative activity after I/R injury have not been fully understood.We studied possible beneficial effects of HBO on apoptosis and tubular cell regeneration after renal I/R injury in rats.Material and Methods: Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into three groups: sham, sham operated rats; I/R, animals submitted to I/R; and I/R +HBO; I/R rats exposed to HBO. Tubule cell apoptosis was confirmed by terminal deoxynucleotudyl transferase-mediated uridine triphosphate nick end labelling (TUNEL) assay. Cellular proliferation activity was determined using anti-Ki-67 antibody.Results: Significant decrease in apoptotic cells and increase in proliferative reaction were observed in I/R +HBO group compared to I/R group.Discussion: Several studies showed the beneficial effects of HBO on the histopathological changes after renal I/R.Cellular death that occurs after I/R injury was morphologically divided into apoptosis and necrosis, both of which is positioned as different cellular death.The apoptotic cells show the various morphological changes as chromatin aggregation, fragmentation of DNA, and cell membrane blebs in the early stage and finally disappear by phagocytosis.By continuing the death of two types of cells, renal failure is sustained and leads to poor prognosis. Apoptosis in the caspase cascade, initiator and effector are stimulated to cause to activate the cascade and induce irreversible apoptosis. That the distal tubule is easily injured by I/R is consistent with previous study by Kreisberg et al. although exact mechanism might not be fully explained at the moment.Apoptotic cells by TUNEL method 24 hours after I/R injury were significantly observed in the distal tubule of the cortex and medulla in I/R groups, not observed in I/R+HBO group suggesting that HBO treatment inhibited the activity of caspases.The following several studies support our findings in this study.Sharples E et al. reported biochemically and histologically that erythropoietin prevented caspase-3,-8, and -9 activation in vivo and reduced apoptotic cell death caused by renal I/R in rats. Wang W et al. showed that netrin-1, a diffusible laminin-related protein, protected renal tubular epithelial cells against renal I/R by suppressing apoptosis and increasing proliferation in transgenic mice. In addition, suppression of apoptosis induced by renal I/R prevented inflammation using a murine model. Wen X et al .described that tubular cell regeneration and proliferation is important element of renal recovery in acute renal injury.The mechanisms involved in the protection by HBO against renal I/R remains unclear.However, HBO would attenuate apoptosis through the caspase cascade after I/R injury in the ischemic region.Further studies will be necessary to elucidate the precise mechanism of HBO and repaired pathway including apoptosis after renal I/R injury.Conclusion: We demonstrated that HBO suppressed apoptosis which caused inflammation after renal I/R and promoted the tubular cell regeneration. HBO has protective effects against AKI caused by renal I/R thorough the inhibition of apoptosis.; 平成27年度
• DOI: 10.15069/00000797; https://doi.org/10.15069/00000797
• Persistent ID (NDL): info:ndljp/pid/9984704; https://dl.ndl.go.jp/pid/9984704
• Collection: 障害者向け資料
• Collection (Materials For Handicapped People:1): テキストデータ
• Collection (particular): 国立国会図書館デジタルコレクション > デジタル化資料 > 博士論文; https://dl.ndl.go.jp/collections/A00014
• Acquisition Basis: 博士論文（自動収集）
• Date Accepted (W3CDTF): 2016-06-03T01:05:16+09:00
• Date Created (W3CDTF): 2016-05-18
• Format (IMT): PDF; application/pdf
• Access Restrictions: 国立国会図書館内限定公開
• Service for the Digitized Contents Transmission Service: 図書館・個人送信対象外
• Availability of remote photoduplication service: 可
• Periodical Title (URI): http://dx.doi.org/10.15069/00000797; http://id.nii.ac.jp/1147/00000797/
• Data Provider (Database): 国立国会図書館 : 国立国会図書館デジタルコレクション; https://dl.ndl.go.jp

• Summary, etc.: 【目的】 急性腎障害 (AKI) は急激な腎機能の低下の結果、体液の恒常性が維持できなくなった状態である。AKI の生命予後は悪く、特に尿細管壊死によるものでは、原因を除去しても直ちには腎機能が回復せず有効な手段はないと報告されている。AKI が持続する場合には、腎機能の低下から深刻な病態へと進行す...

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